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01. PASTEUR Y LA TEORÍA DE LOS GÉRMENES

Un poco de historia

Después de cierto tiempo, un caldo de carne expuesto al aire se pudre. La observación microscópica muestra muchos tipos de microorganismos. Ya que no son observados en el caldo recién cocido, podemos preguntarnos: ¿de dónde vienen?

Hasta 1850-1860 se admitía la teoría de la generación espontánea, es decir que los microorganismos podían surgir espontáneamente como consecuencia de alteraciones en los alimentos.

En base a sus estudios sobre fermentación, Louis Pasteur consideró inadecuada esta explicación. Para él la alteración de los alimentos era una consecuencia de la presencia de microorganismos. Pero, para convencer a sus contemporáneos, Pasteur tuvo que demostrar de manera inequívoca su teoría.

Cuarto experimento

Pasteur prepara sus frascos en "cuello de cisne" y los abre en diferentes lugares encontrando los resultados siguientes:

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LUGAR DE EXPOSICIÓN

(Frascos contaminados / Frascos abIertos)

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Paris (20/20)

Campo (8/20)

Montaña (1/20)

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Por lo tanto, los gérmenes están distribuidos en la atmósfera de forma desigual.

Una revolución científica, tecnológica y social

Las evidencias experimentales presentadas por Pasteur llevaron a sus contemporáneos a sustituir la teoría de la generación espontánea por la teoría de los gérmenes. Se admite que los gérmenes presentes en el medio ambiente son los responsables de las alteraciones de los medios orgánicos (fermentaciones, putrefacción, enfermedades).

La teoría de los gérmenes abrió nuevos caminos en la utilización industrial de los procesos fermentativos, en la conservación de alimentos y en la lucha contra las enfermedades infecciosas.

NUESTRO COMENTARIO

Con pocos elementos es posible montar un experimento que permita reproducir algunos aspectos de las experiencias de Pasteur (Láminas).

BIBLIOGRAFÍA

ORIEUX M. & EVERAERE M.Sciences Naturelles: Anatomie et Physiologie Humaines. Paris, Hachette.

La edición no lleva fecha, pero calculo que fué publicado en los primeros años de la década de 1970.

02. EL LAVADO DE LAS MANOS

En 1850, el médico húngaro Ignaz F. Semmelweis mostró que el número de muertes de mujeres atendidas por fiebre puerperal disminuía cuando el obstetra se lavaba las manos después de una autopsia, y antes de examinar a las parturientas.

Las ideas de Semmelweiss encontraron sustento en la segunda mitad del siglo XIX, con el enunciado de la teoría de los gérmenes (Louis Pasterur) y el descubrimiento del fenol como agente antiséptico (Joseph Lister). Las medidas higiénicas redujeron el número de muertes por infecciones post-operatorias, dando inicio a una nueva era dentro del campo de la cirugía.

A pesar de contar hoy en día con numerosos agentes antimicrobianos, el alto número de infecciones hospitalarias y la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos nos muestran que las medidas de precaución continúan siendo esenciales.

Más de 150 años después de Semmelweiss, el lavado de las manos es una medida fundamental para prevenir la transmisión de gérmenes. Los pasos a seguir para un correcto lavado de manos figuran en numerosas publicaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS). En tiempos de COVID-19 coviene también seguir las recomendaciones para una desinfección con alcohol-gel.

OBJETIVO

Mostrar la importancia del lavado de las manos.

MATERIALES

Por alumno: 1 placa de Petri con agar nutritivo, 2 hisopos esterilizados.

Por grupo: pila (recipiente) con agua y jabón, 1 recipiente para descartar los hisopos, 1 rotulador (pilot).

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard.

Los alumnos trabajan en parejas, siendo uno de ellos el investigador (A) y el otro, el sujeto estudiado (B).

Primera parte

1. Anotar en la parte superior de la placa de Petri el nombre del alumno.

2. En la parte inferior, delimitar con el rotulador dos regiones: antes y después.

3. El alumno A raspará con un hisopo la mano dominante de B: dedos, palma, dorso y regiones interdigitales.

4. Con mucho cuidado A abrirá la placa de Petri y deslizará el hisopo en la región antes, como se muestra en el esquema siguiente.

5. B se lavará las manos con agua tibia y jabón refregando el dorso, las palmas, los dedos y los espacios interdigitales durante 10-15 segundos. A continuación sin tocar nada, B dejará que se sequen al aire. En este punto, la paciencia es fundamental.

6. El alumno A repetirá el procedimiento descripto en los puntos 2 y 3, pero esta vez en la región después de la placa.

Segunda Parte

7. Repetir el procedimiento de 1 a 5 invirtiendo los roles de A y B.

8. Cerrar las placas con cinta adhesiva.

9. Incubar las placas en posición invertida, a temperatura ambiente (25 a 28 grados Celsius), durante 48 horas.

Tercera parte

10. Observar el crecimiento microbiano en las dos regiones de las placas y registrar los resultados como:

(0) = ningún crecimiento; (+) poco crecimiento; (++) mucho crecimiento.

11. Comparar los resultados con los obtenidos por otras parejas. Si fuera posible, estimar la eficiencia del tratamiento mediante la relación:

100 x (Nº de colonias antes del tratamiento – Nº de colonias después del tratamiento) / Nº de colonias antes del tratamiento).

NUESTRO COMENTARIO

Existen numerosas variables de esta actividad, que es muy popular entre los alumnos. Esta actividad es una adaptación de la práctica encontrada en HOME SCIENCE TOOLS .

Desde el punto de vista práctico, el secado previo de las placas es indispensable para la observación de colonias aisladas (Ver COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

Desde el punto de vista de la seguridad, algunas precauciones son necesarias porque en el medio nutritivo crecerán microorganismos desconocidos. Las placas deberán ser cerradas con cinta adhesiva y permanecer cerradas durante todo el análisis de los resultados. Una vez finalizada la actividad, las placas serán esterilizadas antes de proceder al descarte del material.

La figura 1 muestra los resultados obtenidos en el laboratorio didáctico, mostrando la necesidad del/a profesor/a de destacar la importancia de lavarse las manos después de ir al baño y antes de comer.

03. LOS MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE

“Probablemente, las primeras formas de microorganismos habitaban en el agua. Con el paso del tiempo, el suelo resultó infectado y, ahora, se encuentra allí la mayor parte de ellos. Del suelo pasaron al aire por el viento, que levanta partículas de polvo en las cuales están presentes los microorganismos. Desde que vivimos en contacto con el aire, aspiramos enormes cantidades de microorganismos cada vez que respiramos. El aire se deposita en nuestro cabello, ropa y piel. Del aire pasan a nuestro alimento o bebida. Estamos completamente rodeados por microorganismos y debemos aprender a vivir con ellos. Felizmente, la mayor parte no causa daño. Son relativamente pocos los que causan perjuicios. Es contra los que causan enfermedades o estropean nuestros alimentos que debemos prevenirnos” (Neder R.N. Microbiologia, Sao Paulo, Ed. Nobel, 1992).

En esta actividad estudiaremos la distribución de los microorganismos en diferentes ambientes.

MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri con medio nutritivo estéril, 1 rotulador.

PROCEDIMIENTO

Elegir un punto del aula para colocar la placa de Petri.

2. Marcar la placa con el rotulador, indicando el lugar donde esta será expuesta. En el lugar elegido, destapar la placa como se indica en el esquema, esperar 15 minutos y cerrarla nuevamente.

3. Rotular la placa, indicando el grupo y el lugar de exposición elegido.

4. Abrir la placa de Petri durante 15 minutos, en un lugar protegido de las corrientes de aire.

5. Cerrar la placa y sellar con cinta adhesiva.

6. Incubar la placa en el laboratorio, a temperatura ambiente, hasta observar el crecimiento de colonias microbianas.

7. En la clase siguiente, contar el número de colonias en la placa.

8. Reunir los datos de los otros grupos para comparar el crecimiento de microorganismos (número de colonias) en las placas expuestas en diferentes lugares.

RESULTADOS

¿Cuántas colonias se desarrollaron en la placa?

2. Complete la tabla con los datos de la clase.

04. PRODUCTOS NATURALES: INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

En la historia de la humanidad, las especias fueron usadas a raíz de las exploraciones y conquistas. Marco Polo, Cristóbal Colón, Magallanes y tantos otros navegantes recorrieron el mundo en busca de la ruta de las especias: canela, clavo de olor, jengibre, pimienta, etc.

Hasta el siglo XIX, el secado, el salado y el ahumado eran los principales métodos de conservación de las carnes. Además de mejorar su sabor, las especias contribuían con sus propiedades germicidas a prolongar la duración de los alimentos.

Las especias tienen también algunas propiedades terapéuticas bien conocidas: los extractos de pimienta calman los dolores y el jengibre las náuseas y la inflamación, el aceite del clavo es un anestésico y la cúrcuma, un antioxidante.

OBJETIVO

Testar la inhibición del crecimiento bacteriano por algunos productos naturales.

MATERIALES

Por grupo: una placa de Petri estéril con agar nutritivo, 1 swab o hisopo estéril, 1 cultivo de Escherichia coli, discos de papel de filtro estériles, 1 pinza.

Por grupo: Productos naturales disueltos o molidos suspendidos en agua destilada (extractos como aceite de eucalipto, hojas como la menta, bulbos como el ajo, especias como la mostaza, la canela, el clavo, la pimienta, etc.).

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard.

1. Rotular la placa de Petri.

2. Abrir el tubo con el cultivo bacteriano y embeber el hisopo en el caldo; cerrar el tubo.

3. Abrir la placa y frotar cuidadosamente el hisopo por la superficie de la placa, para formar un tapete bacteriano (COMPLEMENTOS TÉCNICOS). Cerrar la placa y esperar a que el líquido se absorba.

4. Abrir la placa y, con la pinza, colocar en la superficie del medio un papel embebido en agua destilada (control).

5. Repetir el item anterior con 3 papeles embebidos en el producto a testar.

6. Cerrar la placa.

7. Incubar la placa boca abajo, a 37 grados Celsius durante 2 días.

RESULTADOS

Reunir los resultados de los grupos y organizar una tabla indicando la inhibición (presencia de un halo alrededor del disco) o su ausencia.

NUESTRO COMENTARIO

Esta actividad suele impresionar a los alumnos. Tuvimos buenos resultados con alumnos de 14 años, del Noveno Año de la Enseñanza Fundamental 2, sin entrenamiento previo en técnicas microbiológicas (Figura).

Los tapetes no están perfectos, pero es posible visualizar claramente la acción inhibitoria de varios productos sobre el crecimiento bacteriano. Obviamente, no se puede comparar la intensidad de inhibición de dos productos diferentes.

Figura: Inhibición del crecimiento bacteriano por extractos de diferentes substancias de origen natural (Ajo, pimienta, canela y wasabi, un producto derivado de raíz-fuerte)

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

- Estudiar la inhibición del crecimiento bacteriano por diversas especias y plantas (clavo, canela, pimienta, orégano, romero, etc.) orientando el trabajo hacia la conservación de alimentos.

- Estudiar la inhibición del crecimiento bacteriano por extractos de plantas utilizadas como desinfectantes (eucalipto, pino, etc.), con vistas a la higiene ambiental.

- Estudiar la inhibición del crecimiento bacteriano por diferentes concentraciones de una sustancia con sabido efecto inhibitorio.

- Estudiar la inhibición del crecimiento de diferentes microorganismos por una misma sustancia determinada.

BIBLIOGRAFÍA

WYMER P. Practical microbiology and biotechnology for schools. London, McDonald & Co., 1987.

05. DESODORANTES: INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

¿Por qué necesitamos desodorantes?

Varios tipos de microorganismos crecen en la piel, especialmente en los pliegues y partes húmedas asociadas a las glándulas sudoríparas.

Su actividad metabólica causa el olor a transpiración.

En la composición química de los desodorantes se incluyen sustancias que promueven la oxidación de ácidos grasos y aminas, como el peróxido de zinc. También se pueden incluir sustancias antibacterianas que inhiben el crecimiento de los microorganismos responsables del olor a transpiración.

Existen diversas formulaciones en el mercado, con o sin perfume, con o sin alcohol, con o sin agentes antibacterianos, presentados en diferentes formas (crema, roll-on, spray).

BIBLIOGRAFÍA

MALAJOVICH M.A. Actividades prácticas – Trabajar en seguridad.

WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, McDonald & Co., 1987.

OBJETIVO Estudiar la acción inhibitoria de varios desodorantes corporales sobre el crecimiento de Micrococcus luteus.

MATERIALES

Una placa con medio nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta o gotero estéril, 1 swab o hisopo estéril, 4 desodorantes corporales (A, B, C y D), 5 discos de papel de filtro esterilizados (COMPLEMENTOS TÉCNICOS), 1 pinza, pilot (rotulador), mechero Bunsen.

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard.

1. Dividir la parte inferior de la placa de Petri en 4 sectores (A, B, C y D).

2. En condiciones asépticas, colocar unas gotas de cultivo de Micrococcus luteus en el agar nutritivo de la placa de Petri. Distribuir con el hisopo o swab.

3. En condiciones asépticas, colocar con la pinza un disco de papel de filtro estéril en el centro de la placa (control).

4. En condiciones asépticas colocar con la pinza en el sector A un disco de papel de filtro mojado con el desodorante A. Lavar la pinza con agua y esterilizarla bajo la llama del mechero Bunsen durante 2 a 3 segundos.

5. Repetir el procedimiento con los desodorantes B, C y D.

6. Rotular la placa e incubar a 30 grados Celsius durante 48 a 72 horas.

7. Observar la presencia (+) o ausencia (-) de un halo alrededor de los discos embebidos con el desodorante.

RESULTADOS

Comparar los resultados obtenidos con cada desodorante, sabiendo que la inhibición del crecimiento alrededor del disco indica la presencia de algún agente químico, inhibidor del crecimiento microbiano.

NUESTRO COMENTARIO

Desde el punto de vista técnico es posible obtener placas mejores reemplazando el hisopo por el asa de Drigalsky, que permite distribuir mejor un césped bacteriano. El problema con tales asas es que las de vidrio se rompen fácilmente y las de plástico no pueden ser esterilizadas, sólo desinfectadas.

La elección de Micrococcus luteus para esta actividad se justifica por tratarse de una bacteria de la flora normal de la piel, que puede ser utilizada en la enseñanza (ver la lista correspondiente en TRABAJAR EN CONDICIONES SEGURAS).

La Figura muestra un ejemplo de los resultados que pueden obtenerse en el laboratorio de enseñanza. Encontramos una acción inhibitoria con los cuatro desodorantes estudiados.

Ensayos complementarios con otros microorganismos (Escherichia coli y Bacillus subtilis) también mostraron resultados positivos.

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

Estudiar diferentes desodorantes .

Figura: Inhibición del crecimiento de 3 microorganismos (M. luteus, E.coli y B. subtilis) por 4 desodorantes del mercado.

06. DENTÍFRICOS: INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Diferentes tipos de microorganismos se desarrollan en la cavidad oral. Muchos son inofensivos, otros no.

Algunas bacterias fermentan los carbohidratos (predominantemente sacarosa) produciendo moléculas de ácido que disuelven las sales de calcio, en un proceso de desmineralización. La destrucción localizada del tejido dental forma la caries dental.

El cepillado de los dientes y el uso de hilo dental son las dos acciones más eficientes para la remoción del biofilm bacteriano, causa de las caries y de la gingivitis.

OBJETIVO

En esta actividad estudiaremos la inhibición del crecimiento de Micrococcus luteus por diferentes dentífricos.

MATERIALES

Una placa de Petri con agar nutritivo estéril, 1 cultivo de Micrococcus luteus, 1 pipeta o gotero estéril, 1 swab (hisopo o cotonete) estéril, 4 tipos de dentífricos, 5 discos de filtro esterilizados, 1 pinza, pilot (rotulador), mechero Bunsen.

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard.

1. Dividir la parte inferior de la placa de Petri en 4 sectores (A, B, C y D).

2. En condiciones asépticas,

- Colocar unas gotas del cultivo de Micrococcus luteus en la superficie del medio nutritivo. Distribuir con el hisopo o swab.

- Colocar con la pinza un disco de papel de filtro estéril en el centro de la placa (control).

- Colocar con la pinza en el sector A un disco de papel de filtro mojado con el dentífrico A.

- Lavar la pinza con agua y esterilizar bajo llama con el mechero Bunsen durante 2 a 3 segundos.

3. Repetir el procedimiento con los dentífricos B, C y D.

4. Rotular la placa e incubar a 30 grados Celsius durante 48 a 72 horas.

5. Observar la presencia (+) o ausencia (-) de un halo alrededor del disco embebido con dentífrico.

RESULTADOS

Comparar los resultados obtenidos con cada dentífrico, sabiendo que la inhibición del crecimiento alrededor del disco indica la presencia de algún agente químico, inhibidor del crecimiento microbiano.

NUESTRO COMENTARIO

Desde el punto de vista técnico es posible obtener mejores placas sustituyendo el hisopo por el asa de Drigalsky, que permite distribuir mejor el césped bacteriano. El problema con dichas asas es que las de vidrio se quiebran fácilmente y las de plástico no pueden ser esterilizadas, sólo desinfectadas.

La elección de Micrococcus luteus para esta actividad está fundamentada por tratarse de una bacteria de la flora normal de la piel, que puede ser utilizada en la enseñanza (Ver la lista correspondiente en Trabajar en condiciones seguras).

La figura 1 muestra un ejemplo de los resultados que pueden obtenerse en el laboratorio didáctico.

Encontramos acción inhibitoria con los cuatro dentífricos estudiados. El procedimiento usado no permite comparar su eficacia.

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

- Ampliar la gama de dentífricos estudiados.

- Estudiar la acción inhibitoria de Micrococcus luteus con diferentes enjuagues bucales.

- Los dentífricos son productos cosméticos utilizados en la limpieza de la cavidad bucal. Investigar su composición.

BIBLIOGRAFÍA

MARTIN A. Antibacterial chemical raises safety issues. The New York Times, 19/08/2011.

WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, McDonald & Co., 1987.

07. LUZ ULTRAVIOLETA: EFECTO GERMICIDA

La supervivencia de un microorganismo expuesto a luz ultravioleta varía en función de la especie y la dosis aplicada.

Las lámparas que emiten luz UV con longitud de onda entre 270 y 230 nm son utilizadas para reducir el número de microorganismos del aire, en superficies de salas quirúrgicas y en salas asépticas donde productos esterilizados son guardados en botellas o ampollas estériles.

La exposición excesiva del hombre a la luz ultravioleta puede causar quemaduras de piel y un cuadro de conjuntivitis, con formación de cataratas en los ojos. Por estas razones se debe tener mucho cuidado en el manejo de una fuente de luz ultravioleta, tanto colocando la fuente de luz dentro de una caja negra, como utilizando la luz UV en el flujo laminar.

El vidrio normal deja pasar el 90% de la luz de más de 350nm y bloquea el 90% de la luz de menos de 300nm, que es la longitud de onda normalmente utilizada. Por eso, las gafas apropiadas y los paneles de vidrio entre la fuente y el operador permiten mitigar los riesgos.

Cuidado! La luz ultravioleta es peligrosa. La fuente sólo puede ser operada por el/la Profesor/a. El operador debe estar protegido por barreras (pared de vidrio, gafas de seguridad, etc.), principalmente en relación con los ojos y la cara. En caso de exposición excesiva, pueden provocarse quemaduras y, en algunas condiciones, un cuadro de conjuntivitis.

BIBLIOGRAFÍA

PELCZAR M.J., CHAN E.C.S. Laboratory Exercises in Microbiology, 4th Edition. New York, Mc Graw Hill, 1977.

OBJETIVO

Estudiar la acción germicida de la luz ultravioleta sobre los microorganismos.

MATERIALES

Siete placas de Petri estériles con medio nutritivo estéril; swabs o hisopos estériles, 1 tubo con un cultivo en medio líquido del microorganismo a estudiar (bacterias como E. coli, B. subtilis o M. luteus; levaduras como S. cerevisiae o Rhodotorula), 6 cartones de cartulina negra agujereada como indicado en el esquema, una fuente de luz ultravioleta.

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard.

1. Rotular una placa como C (control) y numerar las restantes de 1 a 6.

2. Con un hisopo, en condiciones asépticas, inocular la superficie del agar de todas las placas, distribuyendo un césped de microorganismos.

3. Colocar las placas 1 a 6 en posición adecuada para recibir luz ultravioleta.

4. Sustituir la tapa de vidrio de las placas 1 a 5 por los cartones agujereados, como se indica en el esquema adyacente. En la placa 6, colocar el cartón sobre la tapa de vidrio.

5. Exponer las placas a luz UV durante 30 segundos (placa 1), 1 minuto (placa 2), 5 minutos (placa 3), 10 minutos (placa 4) y 20 minutos (placas 5 y 6).

7. Incubar las siete placas a temperatura ambiente por 24 a 48 horas.

RESULTADOS

Observar el crecimiento de los microorganismos en la región de la placa correspondiente al área agujereada de los cartones.

Registrar las observaciones como (++): Crecimiento normal, (+): Crecimiento intermedio y (0): Ausencia de crecimiento

NUESTRO COMENTARIO

Esta actividad siempre despierta el interés de los alumnos. Utilizamos como fuente de luz ultravioleta la lámpara del flujo laminar. Hemos desarrollado esta actividad con Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae y Rhodotorula, que son los microorganismos con los que trabajamos habitualmente.

La figura 1 muestra algunos aspectos del procedimiento. La figura 2 muestra los resultados obtenidos con Rhodotorula. A medida que el tiempo aumenta, resulta más clara la ausencia de crecimiento en la parte del medio que recibió la irradiación.

Figura 1: Detalles del procedimiento (Cartón utilizado, disposición del cartón sobre la placa y organización de las placas en el flujo laminar).

08. PRODUCTOS ANTIFÚNGICOS EFECTO GERMICIDA

En la naturaleza, la producción de substancias antibióticas por microorganismos tiene un papel importante em la competición interespecífica, ya sea porque matan o porque inhiben el crecimiento o la reproducción de otros microorganismos. El hombre utilizo esa propiedad para desarrollar medicamentos que le permitiesen luchar contra las infecciones.

El uso indiscriminado de antibióticos tuvo como consecuencia la proliferación de organismos resistentes, de modo que es conveniente restringir su uso a la clínica y eliminarlos del laboratorio didáctico.

Algunas de las opciones posibles para mostrar la inhibición del crecimiento de microorganismos son los desinfectantes, desodorantes y dentífricos. Otra posibilidad es utilizar soluciones antifúngicas de uso tópico destinadas al tratamiento de micosis superficiales, de bajo costo y venta libre en las farmacias. Estos productos pueden ser testados con Saccharomyces cerevisiae, una levadura vendida comercialmente y utilizada habitualmente en la enseñanza por no presentar riesgo alguno.

¿Desvío de función de productos comerciales? No, teniendo en cuenta que no se pretende evaluar su eficiencia. Para ello, la sociedad cuenta con organizaciones específicas que siguen protocolos estrictos antes de autorizar su entrada em el mercado. El rol del laboratorio didáctico es simplemente motivar a los alumnos mostrando la importancia de la biotecnología em la vida cotidiana y em este caso, en el área de salud.

OBJETIVO

Evidenciar la acción germicida de una solución antifúngica de uso tópico y venta libre en farmacia.

MATERIALES

Una placa con agar nutritivo estéril (Sabouraud), 1 cultivo en caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1 pipeta estéril, 1 swab o palinete esterilizado, una solución antifúngica, 5 discos de papel de filtro esterilizados (COMPLEMENTOS TÉCNICOS), 1 pinça estéril, pilot.

PROCEDIMENTO

Seguir las normas de trabajo standard

Rotular la placa y dividir la parte inferior en 4 sectores (A, B, C e D).

2. En condiciones asépticas,

- Colocar unas gotas del cultivo de Saccharomyces cerevisiae en el agar nutriente y distribuirlas con el swab.

- Colocar con la pinza un disco de papel de filtro estéril (controle) em el centro de la placa.

- Colocar com a pinça um disco de papel de filtro embebido no produto em cada setor (A, B, C e D).

Cerrar la placa. Incubarla a temperatura ambiente (25 a 30 grados Celsius) durante 48 a 72 horas. Observar el crecimiento de las levaduras y la aparición de halos de inhibición.

PERGUNTAS

¿El producto testado mostró alguna acción sobre las levaduras? ¿Cuál es la función del papel colocado em el centro de la placa? ¿Cuál es la función de las repeticiones B, C y D? ¿Cómo interpretaría la eventual aparición de colônias dentro del halo de inhibición?

NUESTRO COMENTARIO

El diseño experimental no permite comparar la eficacia de cada producto, de modo que los resultados son cualitativos (positivos o negativos). Agregamos como control suplementar una placa donde testamos el efecto del alcohol 70%, que fué el único producto con resultado negativo en relación a Saccharomyces cerevisiae (Figura 1).

COMO MONTAR UM PROJETO

Investigar algunas substancias consideradas tradicionalmente como siendo germicidas em la farmacopea casera: aceites esenciales, (coco, clavo de olor, romero), vinagre, ajo fresco etc..

Figura: Efecto germicida de soluciones antifúngicas comerciales sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae.

En el centro de la placa el disco de papel de filtro estéril es el control del experimento. En la parte externa de la placa, varias repeticiones con discos de papel de filtro embebidos en un producto antifúngico.

09. EFECTO DE DOSIS DE UN DESINFECTANTE

Un desinfectante es una sustancia química que mata las formas vegetativas de los microorganismos patógenos, pero no necesariamente sus formas esporuladas. Un germicida difiere de un desinfectante en que mata microorganismos que no necesariamente son patógenos.

Como no trabajamos con microorganismos patógenos preferimos utilizar el término germicida en las actividades de laboratorio.

El desinfectante/germicida de uso doméstico más conocido es el hipoclorito de sodio (NaOCl), comercialmente conocido como “água sanitária” en Brasil, lavandina en Argentina, Paraguay, Uruguay, lejía en España o agua jano en Chile, por ejemplo.

En contacto con agua, los hipocloritos forman ácido hipocloroso que sufre una nueva reacción, originando oxígeno naciente, un poderoso agente antioxidante que puede destruir sustancias vitales.

OBJETIVO

Estudiar la acción germicida de diversas concentraciones de un desinfectante.

MATERIALES

Una placa de Petri con agar nutritivo estéril, 4 tubos con 2 mL de agua estéril, 4 pipetas de 1 mL, 1 pipeta Pasteur estéril, 1 swab (hisopo), 1 tubo con 4 mL de desinfectante, 1 pinza estéril, mechero Bunsen, un tubo con el cultivo bacteriano indicador (Escherichia coli, Bacillus subtilis o Micrococcus luteus), pilot (rotulador).

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard

A.PREPARACIÓN DEL TAPETE BACTERIANO

Con la pipeta Pasteur, colocar unas gotas del cultivo bacteriano en la superficie del agar nutritivo. Distribuir con un hisopo (swab) de modo de obtener un tapete como indicado en los COMPLEMENTOS TÉCNICOS.

B.PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DEL DESINFECTANTE

Transferir 2 ml de la suspensión bacteriana de un tubo al siguiente, iniciando el procedimiento a partir del tubo con el desinfectante concentrado. Utilizar una pipeta diferente de modo de evitar el arrastre de material de un tubo a otro.

Un esquema general de los pasos a seguir se encuentra representado en la Figura 1.

Entre una dilución y la siguiente, mezclar bien el contenido de los tubos, agitando por rotación.

Figura 1: Preparación de las diluciones del desinfectante.

C. EL TEST

1. Rotular la placa dividiéndola en 6 sectores.

2. Colocar un disco estéril seco como control negativo (C-).

3. Tomar otro disco estéril con la pinza y embeberlo en la solución más diluida del desinfectante (6,25%). Abrir la placa y colocar el disco en el lugar correspondiente. Cerrar la placa.

4. Repetir el punto anterior con cada una de las soluciones restantes (12,5%, 25%, 50%).

5. Repetir lo mismo con el desinfectante concentrado (Control positivo, C+).

6. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 48-72 horas.

7. Observar los resultados. La presencia de un halo en torno del disco de papel revela la acción germicida del desinfectante.

NUESTRO COMENTARIO

Esta actividad requiere bastante material y su ejecución presenta algunas dificultades. Sin embargo, los resultados son extremamente interesantes. La figura 2 muestra los resultados obtenidos con diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (“água sanitária” Globo, comprada en un supermercado del barrio*). Utilizamos la misma serie de diluciones con dos bioindicadores diferentes: Escherichia coli y Bacillus subtilis.

En el caso de Escherichia coli, se observa la acción germicida con diluciones de hasta 12,5%. En el caso de Bacillus subtilis, la acción germicida es mucho menos evidente, revelando la existencia de numerosas colonias resistentes incluso con altas concentraciones.

Figura 2: Efecto de dosis de un desinfectante con dos indicadores biológicos.

10. LAS NORMAS DE TRABAJO STANDARD

1. Acceso al laboratorio con vestimenta adecuada. Quitarse joyas (pendientes, collares) y también sombreros y gorros. No usar ropas demasiado largas ni zapatos abiertos (sandalias). Recoger el cabello. Usar guardapolvo de algodón.

2. Acceso al laboratorio limitado o restringido cuando los experimentos están en marcha (Decisión del Profesor).

3. Tener la certeza de haber comprendido bien el procedimiento antes de comenzar.

4. Lavarse las manos antes y después de realizar el procedimiento.

5. No fumar, beber, comer, chupar caramelos, morder lápices, ponerse lentes de contacto o cosméticos.

6. Mantener la mesada bien organizada.

7. Utilizar las técnicas asépticas apropiadas para trabajar con cultivos bacterianos, microbiológicos o virales.

8. No pipetear con la boca, minimizar la formación de aerosoles.

9. Limpiar la mesada al menos 1 vez al día y cada vez que se produzca un derrame con un desinfectante apropiado.

10. Limpiar y descartar adecuadamente el material utilizado.

Corresponde al Profesor limitar el acceso al laboratorio durante el desarrollo de las actividades, sin permitir a los alumnos llegar tarde o salir antes de terminada la clase, y por su parte no dejar a los alumnos solos.

Estas normas representan un cambio de comportamiento en el laboratorio, tanto para los docentes como para los alumnos.

11. EL NÚMERO DE BACTERIAS DE UM CULTIVO

El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de microorganismos viables en un medio líquido.

Cuando la concentración es baja se procede a filtrar la muestra a través de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una placa de Petri. Los microorganismos retenidos en la membrana se desarrollarán formando colonias, permitiendo su cuantificación.

Cuando la concentración es alta, se procede a la preparación de diluciones seriadas en una secuencia de 1:10, alcanzándose diluciones de 10-7 o mayores. Pequeñas alícuotas de esas diluciones son sembradas en medio nutritivo en placa, donde las bacterias se desarrollan formando colonias.

En las placas donde la concentración de la alícuota sembrada es muy alta, las bacterias formarán un césped, pero si la concentración es muy baja, el número de colonias podrá ser muy bajo. Entre los dos extremos, alguna de las placas contendrá un número de colonias entre 20 y 300, permitiendo la cuantificación.

Como esta técnica demanda mucho material, consideramos que una simplificación como la de Wymer puede ser muy útil en un laboratorio de enseñanza.

OBJETIVO

Determinar el número de microorganismos de un cultivo bacteriano.

MATERIALES

Cultivo de Escherichia coli preparado el día anterior y diluido a 10-4 un rato antes de la clase, 1 placa de Petri con medio nutritivo, 5 tubos de ensayo con 4,5 ml de solución salina estéril, 1 pipeta de 1 ml, 1 pipeta Pasteur, recipiente de descarte con desinfectante, cinta adhesiva, marcador, estufa a 37 grados Celsius.

Antes de comenzar, verificar la ausencia de agua de condensación en la placa de Petri. En caso contrario ver en COMPLEMENTOS TÉCNICOS: El secado de las placas de Petri.

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard

Todo el procedimiento debe realizarse en condiciones asépticas.

C. SEMBRADO

1. Tomar con la pipeta Pasteur una pequeña cantidad de líquido del tubo F, de concentración 10-9 (dilución 109).

2. Abrir la placa de Petri y dejar caer una gota en el sector rotulado -9.

3. Cerrar la placa y colocar el exceso de líquido en el tubo F.

4. Repetir los pasos anteriores con los tubos E, D, C, B y A.

5. Descartar la pipeta en el recipiente con desinfectante.

6. Cerrar la placa e incubar a temperatura adecuada durante 24 a 48 horas.

RESULTADOS

Observar la placa y buscar un sector donde puedan diferenciarse entre 10 y 20 colonias. Calcular cuántas veces el cultivo A fue diluido en esa gota. En base al número de colonias y a la dilución correspondiente, calcular la concentración de microorganismos en el tubo A.

Pista: se estima que en una pipeta calibrada, 1 ml de líquido contiene 20 gotas.

La dilución del cultivo original fue realizada con una única pipeta, partiendo del tubo más concentrado en sentido al tubo menos concentrado. Al sembrar invertimos ese sentido. ¿Cuáles son los errores introducidos con estos procedimientos?

NUESTRO COMENTARIO

Las actividades prácticas de titulación demandan una cantidad grande de material, lo que muchas veces resulta inviable en un laboratorio de enseñanza. Este protocolo, tomado del libro de Wymer, “Practical Microbiology and Biotechnology for Schools”, resulta muy interesante porque permite introducir el procedimiento de un modo bastante simple. De todos modos exige de cierta experiencia previa y bastante habilidad manual.

Los resultados pueden observarse en la Figura1.

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

La técnica puede ser aplicada para determinar la concentración de microorganismos en agua o a lo largo de una fermentación, siempre y cuando se utilicen los medios de cultivo correspondientes.

Figura 1: Titulación de un cultivo de Escherichia coli. Se observa la misma placa con y sin el rotulado.

12. CÓMO SECAR LAS PLACAS DE PETRI

Muchas actividades que se presentan en estas guías exigen que el agar nutritivo esté seco. En caso contrario, en vez de obtenerse colonias aisladas, las bacterias crecerán formando una mancha. Es un detalle que puede arruinar todo el trabajo.

Existen varias formas de obtener placas secas:

1. Esperar antes de colocar el medio nutritivo en la placa. Cuando el medio está muy caliente ocurre la condensación de vapor de agua, tener cuidado! Si el medio se enfría se formarán grumos. La temperatura ideal es de 50 grados Celsius.

2. Dejar las placas a temperatura ambiente, en posición invertida, hasta que se sequen. En la heladera siempre ocurre la condensación de vapor de agua.

3. Secar las placas en la estufa.

Abrir las placas y colocarlas rápidamente en la estufa, en la posición que se muestra en la figura anexa. Esperar hasta que se evapore el agua de la condensación y cerrar las placas. No contaminan.

13. TÉCNICA DEL TAPETE MICROBIANO

La técnica del césped microbiano permite obtener una capa homogénea de crecimiento bacteriano, por medio del sembrado de una suspensión bacteriana en una placa de Petri que contiene un medio nutritivo sólido adecuado. La técnica se aplica también a algas y levaduras.

Generalmente es utilizada para evidenciar la acción inhibidora o germicida de alguna sustancia sobre productos naturales, desodorantes, dentífricos y luz ultravioleta).

MATERIAL

Placa de Petri con agar-nutritivo estéril, ansa de níquel-cromo o hisopo (swab), suspensión bacteriana.

PROCEDIMIENTO

1. En condiciones asépticas y sin perforar el agar, colocar en la superficie del medio el volumen recogido con el ansa o una gota de la suspensión. Este material es el inóculo inicial.

2. Distribuir el inóculo inicial en líneas muy juntas, de modo de cubrir toda la superficie del medio. Será necesario girar la placa varias veces para cubrir toda la superficie sin perforar el agar nutritivo.

14. TÉCNICA DEL AGOTAMIENTO DEL INÓCULO

La técnica de agotamiento del inóculo permite obtener colonias aisladas, a partir de una suspensión bacteriana sembrada en una placa de Petri que contiene un medio nutritivo sólido adecuado.

MATERIAL

Mechero Bunsen, placa de Petri con agar nutritivo estéril, ansa de níquel-cromo, suspensión (o cultivo) de Escherichia coli.

PROCEDIMIENTO

1. Encender el mechero Bunsen.

2. Marcar en la base o en los costados de la placa los puntos A, B, C y D.

3. En condiciones asépticas y sin perforar el agar, colocar en la superficie del medio (punto A) el contenido recogido con el ansa en la suspensión. Este material es el inóculo inicial.

4. Flamear el ansa y distribuir el inóculo inicial en forma de líneas paralelas dentro del área que corresponde a A.

5. Flamear al ansa y girar la placa para sembrar en el área correspondiente a B, en ángulo recto respecto de las líneas paralelas ya hechas.

6. Flamear el ansa y girar la placa para sembrar en el área correspondiente a C, en ángulo recto a las líneas paralelas previamente hechas.

7. Apagar el mechero.

8. Incubar las placas a 37 grados Celsius, con la tapa colocada hacia abajo.

9. Las colonias aisladas deben aparecer en la zona sembrada al final (región CD del esquema).

NUESTRO COMENTARIO

Se trata de un procedimiento de rutina en el aislamiento de bacterias de cultivos puros. Si este fuera el objetivo conviene preparar una suspensión con una mezcla de dos especies que puedan ser diferencias por el color de las colonias, utilizando por ejemplo Escherichia coli (colonias blancas) y Micrococcus luteus (colonias amarillas).

Antes de iniciar el procedimiento verificar que la placa de Petri esté bien seca, porque la humedad condensada sobre el medio arrastra las bacterias sobre la superficie de la placa, formándose una mancha en vez de colonias aisladas.

NUESTRO COMENTARIO

Este protocolo fué desarrollado en 2011 por Luciana Bokehi y Vítor Veloso Absalão, como trabajo de finalización del Curso Técnico (Nivel Medio) de Biotecnología en el Instituto de Tecnologia ORT de Rio de Janeiro.

Tuvo varias aplicaciones: en la materia Química Biológica del mismo Instituto y en el entrenamiento práctico de los vencedores de la Olimpíada Brasileña de Biología, como preparación para las competiciones íberoamericanas e internacionales de 2011 e 2012.

BIBLIOGRAFÍA

MARTINEZ, E.R.M. e PAIVA, L.R.S. ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS: UMA PRÁTICA PARA O ENSINO DE GENÉTICA. Acessado em 01.10.2011

UNIVERSITY OF OXFORD. Kitchen electrophoresis. Acessado em 01.10.2011

Colorful Electrophoresis. Acessado em 09.10.2011

Two Simple and Inexpensive Laboratory Exercises for Teaching Agarose Gel Electrophoresis. Acessado em 09.10.2011

Electroforesis Casera. Acessado em 09.10.2011