educbiotecnologia - Micropropagación

Dracaena sanderiana es un arbusto perenne, de la familia de las Ruscaceae, que puede alcanzar una altura de 1,5m. De origen africano, se adapta bien a los climas cálidos y húmedos.

Con el nombre de bambú de la suerte, Dracaena es una planta de interior poco exigente que crece bien a una temperatura entre 20 y 30 grados Celsius, con iluminación indirecta. Se multiplica fácilmente por estacas.

El cultivo en agua

1. Cambiar el agua semanalmente.

2. Evitar el agua de la canilla (grifo), rica en cloruros y fluoruros a los cuales la planta es sensible, y reemplazar por agua mineral. Como elecciones alternativas, considerar agua de lluvia y agua destilada. Si tuviera que utilizar agua de la canilla, dejar reposar 24 horas antes de realizar el cambio.

3. Cada dos o tres meses, adicionar 2 gotas de fertilizante de plantas para acuarios (peceras).

4. Colocar piedritas en el fondo para sostener el tallo.

5. Mantener la boca de los frascos cerrada con algodón, para evitar la proliferación de mosquitos.

OBJETIVO: Propagar una rama de Dracaena sanderiana por estaquillado.

MATERIAL

Una rama grande de Dracaena sanderiana, 1 cuchillo, recipientes adecuados, piedritas de acuario o equivalentes, agua mineral, parafina derretida.

PROCEDIMIENTO

1. Retirar las hojas de la rama de Dracaena, dejando solo algunas hojas del extremo superior.

2. Cortar la rama de Dracaena de modo a obtener estacas de aproximadamente 15 a 20 cm. El corte debe ser realizado en la mitad de un entrenudo y cada estaca debe incluir al menos un nudo. Mantener la posición original de las estacas.

3. Mojar el corte superior de las estacas con la parafina. El sellado evitará la contaminación bacteriana pero, obviamente, el tratamiento no se aplica a la estaca de la extremidad superior.

4. Colocar las estacas en un recipiente, manteniéndolas en posición vertical con las piedritas del acuario.

5. Adicionar agua mineral verificando que la capa de agua alcance 1cm o 2cm por encima de las piedritas y cubra aproximadamente 1/3 de la estaca.

6. Cambiar el agua semanalmente y, cuando se formen las raíces, trasplantar a tierra.

El género Saintpaulia cuenta con 6 especies, denominadas habitualmente violetas africanas en homenaje al barón Walter von Saint Paul St Claire, quien las descubrió a finales del siglo XIX en las montañas de Usambara, Provincia del Cabo, Sudáfrica.

Las violetas africanas son plantas relativamente fáciles de cultivar. Las hojas no deben mojarse y el riego habitual debe ser realizado desde abajo, dos veces por semana. La forma más simple de multiplicación es por enraizamiento de las hojas.

La edición especial de la “Revista dos Amantes da Natureza VIOLETAS” indica que el método más fácil para propagar (= clonar) las violetas es el de enraizar las hojas en agua.

“Con este objetivo, seleccione hojas de tamaño medio y remuévalas de la planta, pero dejando los pecíolos (cabitos) de 3 a 5 centímetros. En el pecíolo de cada hoja, realice un corte transversal con una cuchilla bien afilada. Llene un vaso con agua y coloque un pedazo de papel de aluminio en la boca del vaso. Realice un corte en el aluminio e inserte la hoja, de modo que una parte del pecíolo quede sumergida en el agua. Coloque el vaso en una ventana bien iluminada, pero no con sol directo. En condiciones normales, a partir de ahí, las raíces se formarán entre 2 y 4 semanas. Cuando las nuevas hojas, debidamente enraizadas, alcancen aproximadamente 3 cm de largo, se trasplantan los plantines a un vaso con tierra”.

También pueden ser colocados en tierra, luego de mojar colocar en el pecíolo un poco de hormona de enraizamiento, adquirido en el comercio.

Para que los plantines se desarrollen bien, se deben tener en cuenta varios factores: temperatura, irrigación, humedad ambiente, iluminación, composición del suelo, fertilizantes.

Temperatura: 22 a 24 grados Celsius

Irrigación: A temperatura ambiente, evitando a agua clorada o alcalina. El suelo nunca debe estar encharcado. No es recomendable mojar las hojas.Vasos de 12 a 15 cm de diámetro deben ser regados 3 veces por semana, y vasos menores con mayor frecuencia. El método más práctico es regar desde abajo, por capilaridad, con la condición de regar una vez por mes por arriba y drenar las sales acumuladas.

Humedad: 40 a 60 % Puede ser obtenida colocando las violetas sobre una bandeja con gravilla y agua.

Iluminación: Procurar un término medio. En caso de usar luz artificial utilizar 2 lámparas fluorescentes de 40 watts durante 12 horas por día, a una distancia mínima de 15 a 20 cm, para un grupo de 9 a 12 vasos.

Suelo: Una mezcla adecuada está formada por una parte de tierra común de Jardín, 1 parte de compost orgánico y 1 parte de arena de construcción. Después de tamizar, la mezcla será esterilizada.

Abono Inorgánico: NPK 10-10-5 ou 20-20-10

Abono Orgánico: harina de hueso, harina de pescado, estiércol, compost orgánico, torta de soja, torta de algodón o torta de papaya.

Frecuencia: 1 vez por mes

OBJETIVO

Clonar violetas africanas (Saintpaulia) a partir de hojas.

MATERIAL

Una planta de violeta africana, un cuchillo afilado, vasitos de plástico con tapa, papel de aluminio, agua, pilot (rotulador).

PROCEDIMIENTO

¿Cuántas plantas hijas obtuvimos a partir de la planta madre? ¿Cuánto tiempo demoró el proceso de enraizamiento? ¿Cuáles fueron los cuidados brindados a los plantines?

NUESTRO COMENTARIO

Además de ser la forma más simple de iniciar el clonado de la violeta africana, la propagación en agua permite observar el crecimiento de las raíces y la aparición de las hojitas. La figura muestra la importancia de efectuar un pequeño corte en el pecíolo de las hojas puestas a enraizar en el agua. El uso de un cuchillo puede evitarse raspando con la uña el pecíolo, a 1 cm de la base de la lámina foliar. Los dos principales inconvenientes del enraizamiento en agua son la putrefacción de los pecíolos y la necesidad de traspasar la planta a tierra. En la propagación directa en tierra, las raíces crecen mejor, pero no es posible visualizar su crecimiento.

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

- Estudiar el efecto de la hormona de enraizamiento sobre la propagación.

- Estudiar el efecto de la composición del suelo.

Figura: a la izquierda, enraizamiento en agua; a la derecha enraizamiento en tierra.

03. OBTENCIÓN DE CLONES DE REPOLLO A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES

El género Brassica incluye una enorme variedad de plantas utilizadas en la alimentación, ya sea por sus hojas (repollos, coles, coles de Bruselas), sus flores (coliflor, brócoli), sus raíces (nabo, rábano), sus semillas (mostaza) y su aceite (canola).

El repollo común (Brassica oleracea var. capitata) se caracteriza por sus numerosas hojas gruesas y superpuestas. Dentro de la cabeza, se encuentra el tallo, con una gema terminal y numerosas gemas axilares bien desarrolladas (Figuras 1).

La clonación de individuos de una determinada especie vegetal a partir de segmentos nodales permite una propagación vegetativa rápida de los ejemplares considerados más interesantes. El método consiste en el aislamiento de un fragmento del tallo con gemas axilares y su transferencia a un medio de cultivo apropiado, donde se desarrollarán las plantas hijas.

El método ha sido usado para la propagación vegetativa, tanto in vivo como in vitro.

Figura 1. A la izquierda, cabeza de repollo; al centro corte de la cabeza de repollo; a la derecha, el tallo de repollo con las yemas

OBJETIVO

Obtener clones de repollo a partir de segmentos nodales con gemas axilares.

MATERIALES

Una cabeza de repollo, 1 cuchillo, 1 azulejo o tabla para cortar, bolsas pequeñas del tipo ziploc, papel toalla, un frasco spray con agua.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar varias capas de papel toalla dentro de las bolsitas. Humedecer levemente el papel, mediante 3 o 4 rociados con el frasco spray. CUIDADO! No colocar agua en exceso.

2. Deshojar la cabeza de repollo, con las manos. Identificar las gemas axilares y la gema terminal.

3. Cortar el tallo en rodajas y colocar cada una de ellas en una bolsita, cuidando de no invertir el sentido de polaridad natural de la planta (Figura 2).

4. Incubar en presencia de luz y observar periódicamente.

Figura 2: Las etapas del procedimiento

RESULTADOS

¿Cuántas yemas se desarrollaron? ¿Cuánto tiempo tardaron las yemas en desarrollarse?

NUESTRO COMENTARIO

Obtuvimos buenos resultados siguiendo este procedimiento (Figura 3). También testeamos otros materiales como tierra, arena, y una mezcla de tierra y vermiculita. En todos los casos, las gemas axilares se desarrollaron bien. Intentamos la transferencia en tierra, pero a pesar de que los clones sobrevivieron un tiempo no alcanzamos a observar ningún enraizamiento (Figura 4). También transferimos algunos clones a medio semisólido (0,2% de Nutrikelp y 0,8% de agar), donde observamos la formación de un callo espectacular (Figura 5).

04. SIEMBRA Y CULTIVO IN VIVO e IN VITRO DE ESPORAS DE HELECHOS

En algunas especies de helechos la única forma de obtener mudas es por división del rizoma y posterior plantío en tierra. Con especies raras o cuando se precisa un número grande de mudas, el método a seguir es la siembra de esporas. En climas templados o fríos el mejor momento es el inicio de la primavera.

COLECTANDO ESPORAS

Las esporas se encuentran en los esporángios, que están agrupados en soros en la parte inferior de la hoja. El color marrón, casi herrumbre de los soros, indica que están maduros. Basta colocar un fragmento de hoja en un sobre blanco y aguardar una o dos semanas para visualizar las esporas como un polvo fino.

SEMBRANDO EN TIERRA

Preparación del substrato

Riegue la tierra y tape con plástico transparente enterrando los bordes. Dejar al sol durante 5 a 6 dias, o 10 a 15 días si la temperatura estuviera baja. El calor del sol calentará la tierra a 40 o 50 grados Celsius, eliminando insectos, nematodes y semillas de malezas, pero permitiendo que las bacterias benéficas sobrevivan. Adaptado do Boletim Agrário

Siembra de las esporas

1. En un recipiente o maceta baja, colocar una camada de piedritas y el substrato previamente tratado.

2. Distribuir las esporas en la superficie con un tamiz fino o un paño del tipo Perfex.

3. Cubrir el recipiente con un saco plástico transparente y colocarlo sobre un plato con agua en un lugar sombreado.

4. Aguardar unas 6 semanas hasta observar una especie de lodo verdoso sobre la tierra, y más tarde los protalos y las mudas.

5. Separar las mudas con una pinza y transferirlas a un recipiente mayor.

Observación: de la siembra de las esporas hasta la formación de las mudas pueden pasar varios meses.

Siembra en agar

El substrato puede ser substituido por un medio mineral simple, habitualmente utilizado para musgos, solidificado con agar.

Disolver en un litro de agua destilada: 0,8 g de Nitrato de Amônia (NH3NO3); 0,1 g de Cloreto de Cálcio (CaCl2.2H2O); 0,1 g de Sulfato de Magnésio (MgSO4); 0,46 g de Fosfato Monopotássico (KH2PO4); 0,26 g de Fosfato Dipotássico (K2HPO4); 0,02 g de Sulfato de Ferro (FeSO4.7H2O)

Ajustar el pH a 7 con KOH o HCl.

Adicionar 15 g de agar bacteriológico y calentar hasta la fusión. La fusión del agar ocurre cuando la temperatura pasa de 90 grados celsius y solidifica abajo de 50 grados Celsius.

Esterilizar y distribuir en placas de Petri o frascos esterilizados previamente.

Dependiendo de la precisión de las balanzas disponibles y de la cantidad de medio que se necesita preparar, puede ser conveniente preparar soluciones-madre de las sales.

La contaminación con hongos, cuyas esporas están asociadas a las de los helechos, es frecuente. Se puede disminuir colocando 1 ml de una solución de fenol 0,5 o 0, 05 % en la superficie del agar el día anterior a la siemmbra de las esporas.

Dentro de la familia Brassicaceae, antiguamente denominada Cruciferae, el género Brassica comprende un amplio grupo de especies que incluye el repollo, la berza, el nabo, la coliflor, la colza, la canola y la mostaza.

Las mostazas son de gran interés económico debido a sus múltiples usos en la alimentación y en la producción de aceites y grasas vegetales. También son aprovechadas como abono verde en la fito-remediación.

A fines de la década de 1980, la Universidad de Wisconsin seleccionó diversas variedades de Brassica rapa de crecimiento rápido (RCBr o Fast Plants).

Estas plantas modelo se caracterizan por tener un ciclo de vida corto y requerir poco espacio, siempre que se cultiven en condiciones controladas (composición del suelo, luz, temperatura). En Estados Unidos, las semillas son comercializadas para la enseñanza y la investigación.

Tuvimos acceso a esas plantas en 1992, dentro de una experiencia realizada en paralelo con otras escuelas. Nuestro objetivo era comparar el crecimiento de las Fast Plants y de las mostazas comunes. Lamentablemente, sin la posibilidad de controlar las variables ambientales y con una temperatura carioca de 40 grados Celsius, las Fast Plants murieron rápidamente.

En función de dicho fracaso y de la imposibilidad de importar semillas RCBr, se tomó la decisión de desarrollar las actividades prácticas con semillas de Mostaza Lisa (Brassica juncea), vendida localmente. Estas plantas germinan en 5 a 7 días y tienen un ciclo de vida de 45 a 65 días. La altura es de 35 a 40 cm y el regado, diario.

Una de las aplicaciones con mejores resultados fue el seguimiento del desarrollo de los plantines de mostaza a partir del epicótilo, configurando un tejido de órganos de fácil realización en el laboratorio de enseñanza.

OBJETIVO

Observar el crecimiento de explantes de mostaza.

MATERIAL

Semillas de mostaza, 1 placa de Petri con medio agar-agua (0,8%), 1 bisturí, 1 pinza, 1 rotulador indeleble, elementos para la germinación de semillas.

PROCEDIMIENTO

Germinación de las semillas. Varios procedimientos se describen en la Guía 54: Cómo germinar semillas.

Obtención y sembrado de los explantes

1. Cortar la parte superior de los plantines y colocar los explantes en medio con agar- agua, sin dejar que los cotiledones queden en contacto con el medio.

NUESTRO COMENTARIO

El experimento muestra la importancia de los cotiledones que mediante su capacidad fotosintética aseguran la nutrición de la planta hasta el desarrollo de las hojas. Por otro lado, la regeneración de las raíces muestra la totipotencia de la planta.

Desde el punto de vista docente, este experimento tiene la ventaja de no requerir condiciones asépticas ni medios complejos. Para el alumno, la dificultad reside en realizar un trabajo que exige concentración y minuciosidad.

Las imágenes muestran el aspecto de las placas a lo largo del experimento.

¿CÓMO ARMAR UN PROYECTO?

- Comparar el desarrollo de las hojas y el crecimiento de las raíces en agar-agua y en un medio con agar, agua y sales minerales.

- Comparar el desarrollo de las hojas en agar-agua y en tierra.

- Realizar el experimento con otras plantas (rabanito, por ejemplo).

Las mentas o hierbabuenas son plantas perennes, raramente anuales, que se expanden mediante estolones. El fenómeno de hibridación interespecífica que ocurre naturalmente, dificulta la caracterización de las especies, clasificadas dentro del género Mentha (familia Lamiaceae).

Originarias del Mediterráneo, las mentas fueron introducidas en Europa por los romanos. En medicina natural, la menta es utilizada en tizanas, infusiones y cataplasmas por sus propiedades estimulantes, carminativas y antiespasmódicas. Debido a su aroma y sabor característicos, la menta es muy apreciada en el arte culinario. Tanto su óleo esencial como el mentol, son aromatizantes populares en la instruida cosmética y de alimentos (dulces y chocolates). Por otro lado, las propiedades insecticidas del aceite esencial explican su inclusión como plantas acompañantes en la agricultura orgánica.

En Brasil, las especies más comunes son la Mentha spicata o hierbabuena común (en la foto superior), la Mentha piperita (menta piperita), y la Mentha pulegium o poleo.

OBJETIVO

Cultivo in vitro de segmentos nodales de hierbabuena (Mentha piperita).

MATERIALES

Una planta de hierbabuena, azulejo, cuchillo, 1 frasco con agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos con agua estéril, 6 tubos de ensayo o frascos pequeños con medio nutritivo* estéril, palitos estériles, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog, Taji o Knop) es una solución de sales minerales a la que se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los Fundamentos Técnicos.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%.

Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70 %. Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

A. Establecimientos de un cultivo aséptico

1. Separación de los explantes: En un azulejo bien limpio, cortar segmentos del tallo de la hierbabuena conteniendo un nodo y eliminar las hojas. Lavar los explantes.

2. Desinfección de la superficie de los explantes: Pasar rápidamente el material por alcohol 70 % y sumergir el explante durante 10 minutos, en una solución de agua sanitaria diluida al 50% adicionada con 1 gota de detergente; agitar suavemente durante todo el proceso de desinfección.

3. Lavados en agua destilada estéril: Hacer tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, con agitación suave.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, transferir los explantes a los recipientes con medio nutritivo.

5. Incubación: A 20-28 grados Celsius, en presencia de luz.

6. Seguimiento: Registrar semanalmente as observaciones.

B. Regeneración de la planta

Luego del crecimiento de hojas y raíces, transferir los explantes a un medio sin agua de coco y sin azúcar. Siempre en condiciones asépticas.

Una vez que se desarrollan las raíces y antes de transferir la planta a tierra, eliminar el agar por lavado.

Controlar la humedad por un tiempo y proteger las plantas de la iluminación solar directa hasta su adaptación a las condiciones ambientales.

NUESTRO COMENTARIO

La hierbabuena comprada en el comercio viene muy sucia, y a pesar del cuidado en la desinfección de los explantes tuvimos un alto número de contaminaciones. Para contrarrestar este problema, sembramos Mentha piperita en un vaso y retiramos los segmentos nodales de las plantes que crecieron (Figura 1).

El protocolo puede simplificarse. La hierbabuena no es una planta exigente y también se desarrolla bien en medio de Knop adicionado con agua de coco o, inclusive, en un medio sólo con agua de coco al 50%. Sin embargo, hasta que crecen las hojas es conveniente mantener las plántulas en un medio con azúcar.

En relación con la esterilización, se puede reemplazar el agua destilada estéril de los lavados por Clor-in 10. El único inconveniente es que los explantes quedan pegajosos y resulta necesario usar un palito estéril para despegarlos de la pinza. Resulta más fácil si el trabajo es realizado en parejas.

El consumo de la raíz de zanahoria (Daucus carota, família Apiaceae) data del tiempo de los Romanos. Documentos del período medieval muestran que las zanahorias eran blancas o púrpuras. En el siglo XVI, una mutación dio origen a una variedad de color naranja, seleccionada por horticultores holandeses como homenaje a la casa de Orange. Hoy en día dicha variedad es la que se encuentra con mayor frecuencia.

En 1958, cultivando explantes de zanahoria en agua de coco, dentro de un dispositivo rotatorio, F. C. Steward mostró la totipotencia de las células vegetales. Ese trabajo innovador abrió las puertas al cultivo de tejidos vegetales y la regeneración de plantas modificadas por ingeniería genética.

Muchas de las plantas cultivadas no pueden ser propagadas directamente por multiplicación vegetativa. Sin embargo, explantes de raíz colocados en un medio con los nutrientes adecuados pueden dar origen a un callo, que es una masa de células no diferenciadas. En el callo aparecen, eventualmente, embrioides que pueden ser transferidos a un medio de diferente composición, donde se desarrollarán regenerando a planta entera.

Un corte longitudinal de zanahoria (Figura 1) muestra una epidermis fina con pelos radiculares, el córtex de tejidos fundamentales y la endodermis. El cilindro vascular está rodeado por el periciclo, que forma las raíces laterales. Dentro se encuentran los vasos del xilema y del floema, el cambio que los origina y tejido parenquimatoso.

Figura 1. Corte longitudinal de raíz de zanahoria

OBJETIVO

Cultivar explantes de tejidos de zanahoria, in vitro.

MATERIALES

Zanahoria, cuchillo, azulejo, frasco desinfectante con agua sanitaria 50%, 3 frascos con agua estéril, pinzas, papel toalla, vaso de precipitados con alcohol 95 %, dos placas de Petri con papel toalla estéril, 4 frascos con medio nutritivo estéril *, palitos estéreles, alcohol 70%, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a la cual se le agregara sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%.

Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasarse alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

A. Esterilización de la superficie de la zanahoria.

1. En un azulejo bien limpio, cortar con un cuchillo un pedazo de zanahoria de 3 a 6 cm, descartando ambas extremidades de la raíz.

2. Raspar para retirar la epidermis y marcar con algún corte la extremidad inferior de la raíz.

3. Desinfectar durante 20 a 30 minutos en agua sanitaria (hipoclorito de sodio) diluida al medio (50%) y con una gota de detergente.

4. Lavar 3 veces en agua estéril durante 1, 3 y 5 minutos, teniendo la precaución de limpiar previamente el frasco y la tapa con alcohol.

5. Agitar suavemente durante todo el procedimiento.

B. Obtención de los explantes

1. Siempre en condiciones asépticas, transferir el trozo de zanahoria a una placa de Petri con papel toalla estéril para eliminar las partes quemadas, con un cuchillo o bisturí estéril.

2. Transferir nuevamente el trozo de zanahoria a una segunda placa de Petri con papel de filtro estéril y cortar una rodaja fina de 1 a 2 mm de espesor.

3. Separar el cilindro vascular y cortarlo en 4 partes, como se indica a seguir.

C. Establecimiento del cultivo

En condiciones asépticas, sembrar los cuatro explantes manteniendo la polaridad, en los frascos con medio nutritivo.

D. Incubación

A 25 grados Celsius, en la oscuridad

E. Subcultivo o repique

Siempre en condiciones asépticas, descartar mensualmente el tejido necrosado y transferir los explantes a medio nuevo. Después de un tiempo, transferir los explantes a un medio nutritivo que contenga sales minerales, pero sin agua de coco, e incubar en presencia de luz.

NUESTRO COMENTARIO

Se trata de un experimento clásico, que da buenos resultados. La principal dificultad reside en la obtención del explante, porque una vez que se utiliza un medio que contiene sacarosa y agua de coco, el trabajo tendrá que ser muy riguroso para mantener las condiciones asépticas y evitar las contaminaciones.

Por otro lado, como puede resultar difícil diferenciar el crecimiento incipiente del callo de una contaminación bacteriana, agregamos en la Figura 2 varias imágenes de callos en diferentes etapas de desarrollo. A menos que se observe claramente una contaminación fúngica o bacteriana es preferible esperar un poco antes de eliminar el material.

La zanahoria no es la única raíz que puede originar callos. Los ensayos con batata (boniato) (Ipomoea batatas) fueron positivos (Figura 3).

La papa (Solanum tuberosum, familia Solanaceae) es una planta originaria de la región andina. En el siglo XVI llegó a Europa donde, después de vencer la resistencia de la población, se transformó en uno de los pocos alimentos consumidos por la población más pobre. A mediados del siglo XIX, el hongo Phytophtora infestan infectó la papa, desencadenando en Irlanda un terrible período de hambruna, que provocó la muerte de un millón de personas y la emigración de buena parte de la población.

En la actualidad, la papa es el cuarto cultivo más importante del mundo. En muchos países, la población depende de la papa y otros tubérculos, como la batata (boniato), para su alimentación. Por ser una planta andina, la papa se torna mucho más susceptible a hongos e insectos cuando es cultivada bajo otras condiciones climáticas.

Por ello, el agricultor debe comprar papa semilla, y cultivarla en ambientes donde no se desarrollen los insectos (escarabajo) y hongos (mildiu) que más afectan al cultivo.

El cultivo in vitro de la papa permite la multiplicación rápida de plantas sanas y la producción de tubérculos libres de virus (Figura 1).

Figura 1. Producción de tubérculos de papa, según Mantell et al. (1994).

" Los plantines producidos en la unidad de cultivo de tejidos son transferidos a ambientes protegidos donde son irrigados con un vaporizador de agua. Los tubérculos obtenidos son plantados en viveros protegidos o en lotes aislados. Después de pruebas rigurosas de control viral, los stocks certificados son liberados a los productores. Los agricultores acreditados producen nuevos tubérculos, que pueden ser entonces certificados y liberados a los productores comerciales. La venta de tubérculos certificados a productores acreditados puede, muchas veces, financiar una unidad de cultivo de tejidos e instalaciones anexas".

OBJETIVO

Cultivar in vitro gemas de papa brotada.

MATERIALES

Papa brotada, azulejo, cuchillo, 1 frasco con solución desinfectante de hipoclorito de sodio (agua sanitaria comercial diluida al medio), 3 frascos con agua estéril, 6 tubos de ensayo con medio nutritivo* con agua de coco estéril, palitos esterilizados, alcohol 70º, mechero Bunsen (opcional).

El medio nutritivo es una solución de sales minerales a la que se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.

El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable.

Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

1. Separación de los explantes: En un azulejo bien limpio, disecar con cuchillos los brotes de papa, de modo de separar fragmentos de aproximadamente 1,5 cm.

2. Desinfección de los explantes: Sumergir el explante en una solución desinfectante de hipoclorito de sodio (agua sanitaria diluida al medio) con 1 gota de detergente, durante 10 minutos, agitando suavemente.

3. Lavados en agua destilada estéril : Tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, agitando suavemente.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, en tubos de ensayo con medio nutritivo básico MS + sacarosa (3% m/v) + agar (0,7-0,8%) + agua de coco.

5. Incubación: A 20-25 grados Celsius, en presencia de luz.

6. Seguimiento: Registrar semanalmente las observaciones.

NUESTRO COMENTARIO

Esta actividad debe ser prevista con bastante anticipación. Elegir en el comercio local papas sin ninguna alteración visible, que serán lavadas cuidadosamente y colocadas en la oscuridad, en la parte inferior de la heladera, hasta que broten.

La desinfección es crítica, pero la manipulación es relativamente simple y los resultados pueden ser espectaculares, mostrando inclusive el crecimiento de pequeños tubérculos (Figura 2).

Figura 2. Cultivo in vitro de brotes de papa.

Dentro del marco del proyecto final “El coco como materia prima”, los alumnos de la Tercera Serie del Curso medio Técnico de Biotecnología realizaron el seguimiento del crecimiento de brotes de papa en medio M&S adicionado con agua de coco. Por falta del tiempo, el experimento no se prolongó más allá del estadio fotografiado (Figura 3).

Figura 3. Crecimiento in vitro de una gema de papa (microscopio binocular, x10). Por Allan Schechter, Ingrid Amaral e Pedro Thiengo.

09. CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMAS PREFLORALES DE COLIFLOR O BRÓCOLI

La coliflor (Brassica oleraceae var. botrytis, família Brassicaceae) es una variedad de col silvestre, originada en el Mediterráneo oriental entre 1500 y 2000 años atrás. Se trata de una planta herbácea bianual, que se reproduce por semillas.

La parte comestible (“cabeza”) es una inflorescencia inmadura redondeada que se inserta en un tallo corto. El color es blanco, amarillo o crema, pero también se comercializan coliflores verdes o rosas. Por ser un órgano meristemático, la cabeza desarrolla tallos con flores amarillas o blancas cuando la planta madura. Esas inflorescencias pueden llegar a medir 100 cm.

En condiciones experimentales, los meristemas revierten hacia la fase vegetativa y se desarrollan como brotes con hojas. Las plantas regeneradas a partir de dichos brotes se usan para la producción de semillas.

Por ser un material barato y fácil de obtener, varios protocolos para el cultivo in vitro de coliflor en el laboratorio de enseñanza se encuentran en Internet. Las pocas diferencias entre ellos parecen depender de la estructura del laboratorio y de la experiencia personal.

OBJETIVO

Cultivo in vitro de coliflor a partir de meristemas preflorales.

MATERIALES

Coliflor, azulejo, cuchillo, 1 frasco con agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos con agua estéril, placa de Petri con papel toalla estéril, bisturí estéril, 6 tubos de ensayo o frascos pequeños con medio nutritivo* estéril, palitos estériles, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a las cuales se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.

El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable.

Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

A. ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ASÉPTICO

1. Separación de los explantes: En un azulejo bien limpio, disecar con un cuchillo varias florcitas de coliflor (tamaño 3 x 5 x 5 mm); Lavar muy bien esos explantes.

2. Desinfección de la superficie de los explantes: Pasar rápidamente el material por alcohol 70% y sumergir el explante durante 10 minutos, en una solución de agua sanitaria diluida al medio adicionada con 1 gota de detergente; agitar suavemente durante todo el proceso de desinfección.

3. Lavados en agua destilada estéril: Hacer tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, con agitación suave.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, transferir los explantes a los recipientes con medio nutritivo.

5. Incubación: A 20-28 grados Celsius, en presencia de luz.

6. Seguimiento: Registrar semanalmente las observaciones.

B. REGENERACIÓN DE LA PLANTA

Luego del crecimiento y propagación, dividir el material y transferirlo a un medio fresco, de modo de obtener numerosos subcultivos. Una vez desarrolladas, transferir las plántulas de los subcultivos a un medio de enraizamiento sin agua de coco, donde, además de crecer las raíces, se fortalecerá y comenzará a fotosintetizar. Siempre en condiciones asépticas.

Antes de transferir la planta a tierra, eliminar por lavado el agar y los vestigios de azúcar. Controlar la humedad por un tiempo y proteger las plantas de la iluminación solar directa hasta su adaptación a las condiciones ambientales

NUESTRO COMENTARIO

La primera medida es conseguir en el comercio una coliflor fresca, compacta y firme, sin manchas amarronadas. En caso de no encontrarse, sustituir por brócoli que es otra variedad de Brassica oleraceae de la cual se consumen los brotes florales.

La segunda es una buena desinfección del explante, en agua sanitaria diluida al medio. Incluso con una buena apariencia, la coliflor procedente del supermercado puede estar muy contaminada, siendo algunas veces necesario aumentar el tiempo de inmersión en el desinfectante y lavar con Clor-in en vez de agua destilada estéril. Después de dicho tratamiento conviene cortar la extremidad quemada del explante.

Sin embargo y a pesar de todos los cuidados, las contaminaciones podrán aparecer una semana después del sembrado, una vez que el explante crece y comienza a abrirse permitiendo el contacto con el medio de las zonas que no fueron alcanzadas por el desinfectante.

Los cultivos y subcultivos bien establecidos son espectaculares (Figura 2). Además del crecimiento de hojas y raíces, en algunos casos se observa la aparición de antocianinas que dan al explante una coloración rosa muy llamativa (Figura 3).

Figura 1. Crecimiento de explantes de brócoli.

10. CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTES DE DISCO CAULINAR DE AJO

El ajo (Allium sativum, família Amaryllidaceae) es una monocotiledónea, originaria de Asia. El bulbo, o cabeza de ajo, está formado por bulbillos o dientes de ajo (Figura 1). Debido a las propiedades aromáticas conferidas por la alicina, dichos bulbillos resultan un condimento indispensable en la cocina de varios pueblos. Con algunas propiedades antimicrobianas, el ajo también es utilizado en la medicina popular para el control de la presión sanguínea, del colesterol, de las enfermedades coronarias y de la ateroesclerosis.

La propagación es asexuada, a partir de los bulbillos. En el ajo-semilla, se consigue eliminar los virus por cultivo in vitro de los meristemas próximos al disco caulinar basal. Existen diversas estrategias de mejoramiento genético, basadas en la información existente en los Bancos de Germoplasma.

Figura 1. El ajo (Allium sativum). Arriba: cabeza de ajo; en el medio: corte de la cabeza de ajo; abajo: corte longitudinal de un diente de ajo, mostrando el disco caulinar basal.

OBJETIVO

Cultivar, in vitro, explantes de disco caulinar basal de ajo.

MATERIALES

Un diente de ajo, bisturí o cuchillo afilado, azulejo, frasco desinfectante con agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos con agua destilada estéril, pinzas, papel toalla, una placa de Petri con papel toalla estéril, 4 frascos con medio nutritivo estéril *, palitos estériles, alcohol 70%, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo es una solución de sales minerales a las que se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.

El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable.

Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

1. Separación de los explantes Pelar el bulbillo (diente de ajo) y cortar justo en la parte seca de la base, como se observa en la figura de abajo.

2. Desinfección de la superficie de los explantes: Esterilizar el bulbillo por inmersión, durante 20 minutos, en agua sanitaria diluida a La mitad y con una gota de detergente.

3. Lavados en agua destilada estéril: Hacer 3 lavados de 1, 3 y 5 minutos, agitando suavemente.

4. Establecimiento del cultivo: En condiciones asépticas, poner los dientes de ajo en una placa de Petri que contiene papel toalla estéril; con un bisturí afilado, separar una lámina de 2 mm del disco basal y cortarlo al medio; transferir los dos explantes al frasco con medio de cultivo estéril, manteniendo la polaridad de uno de los fragmentos e invirtiendo la del otro.

5. Seguimiento: Observar semanalmente el crecimiento de los explantes.

En relación con la bibliografía citada, respetamos la indicación de colocar los dientes de ajo en la heladera durante al menos una semana antes de iniciar la actividad práctica. No agregamos el antifúngico Nipagin (metilparabeno) en los lavados, como recomiendan los autores, pero realizamos los tests del procedimiento.

La ventaja de comenzar con la esterilización del diente de ajo reside en conseguir eliminar los contaminantes. A pesar de que el proceso daña los tejidos externos, esto no parece afectar la lámina caulinar basal que está dentro del bulbillo.

Esta actividad exige tiempo de preparación, porque demanda bastante material estéril, pero el resultado es excelente. Luego de algunas semanas, observamos el crecimiento de los explantes de ajo, a partir de la región meristemática del disco basal del bulbillo (Figura 2).

11. CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES DE MAÍZ

El maíz (Zea mays) es un cereal de la familia Graminaceae originario del continente americano y actualmente cultivado en casi todo el mundo. Como en todas las monocotiledóneas, el cotiledón tiene como función la transferencia de los nutrientes del endosperma a la plántula en desarrollo. En el cultivo in vitro, el medio nutritivo sustituye al endosperma, ya que el embrión es eliminado junto con el cotiledón (Figura 1).

En biotecnología vegetal, esta forma de cultivo in vitro permite rescatar embriones híbridos, resultantes de cruzamientos incompatibles. También se utiliza para romper la dormición de las semillas, acortando así el ciclo de vida de algunas plantas. Se trata de un buen modelo para los estudios fisiológicos ligados a la germinación de las semillas o al desarrollo de las plántulas.

Así como otros órganos de las plantas, los embriones pueden ser cultivados en un medio nutritivo con agua, sales minerales, azúcar y agar.

Figura 1. El maíz y la estructura del grano.

OBJETIVO

Cultivar embriones de maíz, in vitro.

MATERIALES

1 trozo de espiga de maíz, tubos de ensayo con medio nutritivo* estéril, 1 cuchillo o 1 bisturí, palitos estériles, agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos de agua destilada estéril, alcohol 96%, alcohol 70º, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog, Taji o Knop) es una solución de sales minerales a la que se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en los FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.

El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable.

Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

1. Desinfección de los explantes

- Separar con un cuchillo los granos de maíz.

- Desinfectar los granos con solución de agua sanitaria (15 minutos), agitando suavemente.

- Lavar los granos tres veces con agua destilada estéril (1, 3 y 5 minutos)

2. Extracción del embrión

Cerca del mechero Bunsen y con mucho cuidado, presionar suavemente el grano de maíz para facilitar la salida del embrión. Sujetar el embrión con un palito estéril (Participante A)

3. Sembrado del embrión

- Abrir el tubo de ensayo con medio de cultivo estéril y flamear la boca del tubo (Participante B).

- Dejar caer el embrión dentro del tubo (Participante A).

- Flamear nuevamente la boca del tubo y cerrarlo (Participante B).

- A continuación, verificar que el embrión quede en contacto con el medio. Si no fuera así, agitar suavemente el tubo de modo de acomodar el embrión en el medio.

4. Incubación

En presencia de luz, a temperatura ambiente.

5. Establecimiento del cultivo a cultura

Realizar mediciones semanales de la altura del epicótilo (mm).

NUESTRO COMENTARIO

Este protocolo está basado en el trabajo final del Curso Medio Técnico de Biotecnología de Tassia Torres Furtado, Vania Carolina Fonseca da Silva y Vítor Soares Mann titulado “Cultivo de embriões de milho”, desarrollado en 2002 en el Instituto de Tecnología ORT de Río de Janeiro.

Los autores no tuvieron dificultades en el seguimiento del crecimiento del embrión (Figura 2). Ellos trabajaron con dos medios alternativos, medio básico de Taji y medio de coco. Los resultados pueden apreciarse en el Gráfico 1, que muestra que los embriones de maíz se desarrollan mejor en medio básico Taji que en medio de coco. El medio Taji parece agotarse más tarde (3 semanas) que el medio de coco (2 semanas).

En repeticiones posteriores de esta actividad, desinfectamos los granos de maíz con alcohol y con Clor-in 10 sin que se observara un aumento significativo de las contaminaciones.

El género Kalanchoe (familia Crassulaceae, orden Saxifragales) presenta algunas interesantes adaptaciones a climas áridos y cálidos, tales como la apertura nocturna de los estomas. Estos permanecen cerrados durante el día, reduciendo la pérdida de agua.

El proceso fotosintético se caracteriza por un mecanismo alternativo de fijación de carbono, denominado metabolismo ácido de las Crassuláceas (CAM). Por la noche, cuando las plantas abren los estomas, el carbono (CO2) es fijado en forma de ácidos. De día, cuando los estomas están cerrados y en presencia de luz, ATP y NADPH para el ciclo de Calvin, el CO2 es liberado de los ácidos orgánicos e incorporado como azúcar.

Las plantas CAM mantienen una división temporal entre la fase luminosa de la fotosíntesis y el ciclo de Calvin

Dentro del género Kalanchoe encontramos especies que se reproducen siempre sexualmente, formando flores y semillas. También encontramos especies que se pueden reproducir asexualmente mediante la formación, en los bordes de las hojas, de embriones y plántulas que al desprenderse y caer al suelo, generan plantas-hijas.

En algunas especies, como Kalanchoe beharensis (oreja de elefante), portadoras de una versión del gen LEC1 que permite la formación de semillas, la producción de embriones foliares solo ocurre inducida por condiciones de stress. En otras, como Kalanchoe daigremontiana, portadoras de una mutación en el gen LEC1 que no les permite formar semillas, la reproducción asexual es constitutiva (obligatoria).

Los Kalanchoes presentan algunas propiedades medicinales e insecticidas, de modo que pueden resultar tóxicas cuando son ingeridas por niños o animales de pequeño tamaño.

En el laboratorio didáctico, adoptamos Kalanchoe daigremontiana como planta modelo porque permite desarrollar sin mayores contratiempos todos los estadíos de la micropropagación: obtención de los explantes, desinfección y sembrado in vitro; multiplicación mediante subcultivos sucesivos, transferencia a tierra y aclimatación.

OBJETIVO

Reproducir, con Kalanchoe daigremontiana, los principales estadios de la micropropagación.

MATERIALES

Una planta de Kalanchoe daigremontiana, frascos o tubos de ensayo con medio de cultivo* estéril, 1 azulejo limpio, 1 colador, 1 pinza, 1 cuchillo o bisturí, alcohol 70%, Clorin 10 (Dicloro isocianurato de sodio; 10,1 en cloro activo) **, vaso de precipitados de 1 litro, agua destilada, vasos plásticos pequeños con tierra de jardín, filme de PVC (Rolopac), macetas con tierra de jardín.

* El medio de cultivo es una solución de sales minerales gelificado con agar (0,7%). No es necesario agregar sacarosa o azúcar cristal, ni agua de coco. Ver FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

** Clor-in 10 es un producto comercial para la desinfección de hortifrutícolas. Disolver una pastilla en 500 ml de agua, según indicaciones del fabricante. No es necesario enjuagar. Utilizar agua destilada en la desinfección de los explantes y agua de grifo para desinfectar el colador.

PROCEDIMIENTO

La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos.

El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70%. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasar alcohol 70%. Cuidado! El alcohol es inflamable.

Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

Estadio 1: Separación de los explantes y sembrado in vitro

Antes de comenzar: Desinfectar la pinza en alcohol 70% y el colador por inmersión durante al menos 20 minutos en una solución de Clor-in 10, preparada disolviendo una pastilla en 500 ml de agua.

1. Separar los explantes: retirar los embriones foliares de la planta o cortar algunos fragmentos de hoja.

2. Desinfectar los explantes por inmersión y agitación, suave y constante, en una solución de Clor-in 10, preparada como indicado.

3. Eliminar con el colador la solución desinfectante, reteniendo los explantes.

4. Con la pinza, transferir los explantes a los frascos que contienen medio de cultivo.

5. Incubar los explantes en presencia de luz, a temperatura ambiente.

Estadio 2: Multiplicación

La multiplicación es posible cuando el explante inicial es un fragmento de hoja sobre la cual se desarrollan los embriones foliares, como se observa en la imagen de al lado.

Repicar los embriones por transferencia a frascos con medio de cultivo estéril de la misma composición.

Incubar en presencia de luz.

Estadio 3: Transferencia a tierra

Lavar bien las plantitas para retirar el exceso de agar y transferirlas a los vasos con tierra.

Después de un tiempo, repetir el procedimiento, pero esta vez a las macetas definitivas que serán colocadas en el exterior.

NUESTRO COMENTARIO

Kalanchoe daigremontiana, nuestra planta modelo, crece en un medio de cultivo sin azúcar, de modo que el número de contaminaciones es muy bajo. En vez de centralizar la actividad en la composición del medio, como se hace habitualmente, preferimos insistir en los estadíos de la micropropagación. Por otro lado, el uso de Clor- in 10 simplificó enormemente la tarea de desinfección de los explantes.

Obtuvimos un buen número de clones con nuestro grupo de primer año del Curso Medio Técnico de Biotecnología. Las diferentes etapas del trabajo se muestran ilustradas en las figuras anexas.

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

Seguir el crecimiento en medios de cultivo de diferente composición.

BIBLIOGRAFÍA

GARCÊS H. M. P. et al. Evolution of asexual reproduction in leaves of the genus Kalanchoe. PNAS 104:39,2007

Figura 1. Crecimiento in vitro de los explantes. Arriba, de izquierda a derecha: embrión foliar, hoja y fragmento de hoja. Abajo, los mismos cultivos después de un tiempo.

1. FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS

La reproducción asexual es utilizada para obtener una gran cantidad de plantines a partir de una única planta. Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos (gladiolos), rizomas (helechos), tubérculos (papas), tallos (banana), raíces (batata o boniato, manzana, mora), hojas (begonia, espada de San Jorge), estacas (vid), etc. Las plantas obtenidas por propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta madre e idénticas entre sí. En otras palabras, son clones.

Se denomina totipotencia a la capacidad de una célula de generar réplicas del organismo del cual deriva. Restringida en animales, esta propiedad característica de las plantas permite la supervivencia en condiciones ambientales desfavorables o luego del ataque de herbívoros, plagas y patógenos.

El cultivo in vitro o la micropropagación se inicia con la extracción de pequeños fragmentos de tejido tomados de diversas partes de la planta, tales como hojas, raíces, segmentos nodales y yemas axilares, yemas florales y apicales (Figura 1). Una vez limpios y desinfectados, los explantes son transferidos en condiciones asépticas a un medio de cultivo adecuado. Subcultivos periódicos de dichos explantes permiten la amplificación del material y, más tarde, su diferenciación de modo de generar una planta completa.

Figura 1. Las diversas partes de una planta angiosperma.

2. ¿POR QUÉ ENSEÑAR LAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN?

El cultivo in vitro puede desarrollarse inicialmente en un espacio reducido e independientemente de factores climáticos y estaciones del año. Se calcula que 10 m2 de estantes son suficientes para el cultivo de 20.000 plantines.El número de individuos que se produce por cultivo in vitro es mucho mayor al número de individuos que podría obtenerse por el método de multiplicación tradicional. El cultivo de una gema de eucalipto puede originar en un año 75 trillones de mudas en vez de las 100 o 200 que se obtienen habitualmente por estaquillado. Estos resultados son de gran interés para las industrias del papel, celulosa y maderera.

El cultivo in vitro permite la producción y distribución de mudas libres de patógenos a partir de tejidos meristemáticos, que no están infectados por virus. Un ejemplo es la producción de tubérculos de papa libres de virus para la inclusión en programas de certificación de papa-semilla.

También permite la producción de semillas sintéticas, que consisten en un embrioide formado a partir de una masa de tejidos obtenida in vitro, envuelta en una sustancia gelatinosa con nutrientes y cubierta por un plástico biodegradable. El conjunto constituye una semilla artificial que se desarrolla normalmente cuando se siembra en la tierra. Lanzada desde aviones, estas semillas facilitan la reforestación en regiones degradadas de difícil acceso.

Las técnicas de cultivo in vitro de vegetales fueron asimiladas rápidamente por las empresas e instituciones de investigación y desarrollo, porque facilitan el mejoramiento genético de las variedades comerciales y, también, porque representan una etapa indispensable en la obtención de una planta transgénica.

Siendo técnicas de dominio público, relativamente simples y de bajo costo, numerosas empresas las utilizan, en todo el mundo, para garantizar la calidad genética y fitosanitaria de las mudas y semillas comercializadas. Esta tecnología está ampliamente difundida en América Latina, donde representa el segundo producto más comercializado de la biotecnología agrícola, con una amplia difusión en la olericultura, en la horti-fruticultura, floricultura y en la propagación de plantas ornamentales, así como en la producción de plantas de interés industrial (caña de azúcar, café) y de mudas forestales para la industria del papel.

3. EN EL LABORATORIO DIDÁCTICO

Complejos protocolos de investigación en micropropagación vegetal exigen reactivos o condiciones de trabajo no habituales en el laboratorio de enseñanza, pero eso no significa que sea imposible desarrollar algunas actividades. ¿Cuáles son los requerimientos mínimos? Un espacio de laboratorio limpio, una olla a presión, numerosos frascos de mayonesa o mermelada con sus respectivas tapas, algunos reactivos para la preparación de medios, un microscopio o lupa binocular, y un lugar con iluminación directa para la incubación de los cultivos.

Un aparato de flujo laminar es bienvenido, pero también se puede trabajar dentro de una caja plástica (50cm x 40cm x 40 cm) previamente desinfectada. Con estos materiales y sabiendo mantener la asepsia, es posible dar inicio a varios experimentos simples de cultivo de tejidos vegetales (Figura 2).

Diferentes de las técnicas de propagación vegetativa, las técnicas de cultivo de tejidos vegetales representan, en el laboratorio de enseñanza, un desafío considerable para el Profesor: baja repetitividad, mucho trabajo de preparación y numerosas contaminaciones. La lentitud del crecimiento de los explantes puede ser decepcionante para quien está acostumbrado a lidiar con resultados inmediatos. De todos modos, son esas mismas dificultades las que las vuelven más interesantes.

Con cierta dedicación, los experimentos pueden desarrollarse con éxito. Gracias a un movimiento del tipo DIY (Do-it yourself) conducido por personas amantes de las plantas y la jardinería, hoy en día podemos encontrar en Internet protocolos simples y videos entusiastas que muestran cómo proceder para el cultivo in vitro casero de algunas plantas (Kitchen experiments).

Figura 2: El trabajo en el laboratorio de enseñanza, la mesada (a la izquierda) y el flujo laminar (a la derecha).

4. EXPERIMENTOS POSIBLES

Cultivo in vitro de plantas enteras

Las semillas germinan y se desarrollan en le medio de cultivo hasta el momento de la transferencia a tierra. Esta técnica es aplicada comercialmente en la producción de orquídeas, pero en el laboratorio didáctico conviene comenzar con semillas mayores y que germinen más rápido, como la mostaza.

Tuvimos éxito con el cultivo in vitro de embriones de maíz y de embriones foliares de Kalanchoe. En ambos casos, se aislan los embriones y se los transfiere al medio de cultivo.

Cultivo in vitro de órganos aislados

El explante puede ser extraído de un tejido (meristemas) o de un órgano (gemas o brotes, raíces, anteras, etc.). La capacidad de regeneración disminuye con la edad de la planta y también depende del genotipo y de las condiciones ambientales. Mayor en las plantas herbáceas que en las leñosas, dicha capacidad está distribuida en forma desigual dentro de algunas familias de Solanáceas, Crucíferas, Geraniáceas, Compuestas y Liliáceas.

En la literatura correspondiente, la violeta africana (Saintpaulia) figura como una planta modelo, por ser fácil de cultivar mediante propagación vegetativa y adecuada para los estudios morfológicos. Sin embargo, encontramos que las hojas son muy difíciles de desinfectar y tuvimos mejores resultados con hojas aisladas de embriones foliares de Kalanchoe daigremontiana (Bryophyllum).

También obtuvimos resultados satisfactorios con brotes de papa, raíces de arvejas, yemas de repollo y flores de coliflor y brócoli.

Cultivo in vitro de callos

Un callo es una masa de células indiferenciadas que crece a partir de un explante. Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede ser subdividido cada tres o cuatro semanas y mantenido indefinidamente en un medio nutritivo de igual composición. Su transferencia a medios de cultivo con diferentes concentraciones de hormonas induce la embriogénesis y/o la organogénesis. En el laboratorio de enseñanza, zanahorias y batatas (boniatos) produjeron callos espectaculares.

Cultivo in vitro de células aisladas

Los cultivos de células aisladas en medio líquido apuntan a la producción de metabolitos secundarios en fermentadores industriales (alcaloides, perfumes, enzimas, hormonas, etc.). Hasta el momento no realizamos ningún experimento de este tipo, pero ya obtuvimos protoplastos por digestión enzimática de la pared celular.

5. PROCEDIMIENTOS

Un entrenamiento básico en técnicas microbiológicas evita numerosas decepciones.

Antes de iniciar cualquier procedimiento es necesario preparar el medio de cultivo. Además de medios complejos existen medios alternativos de formulación simple y bajo costo. Tanto la composición como la preparación de varios de esos medios están detalladios en la siguiente guía.

Se debe desinfectar el lugar de trabajo con alcohol 96%. También es recomendable lavarse bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, y finalmente, pasar alcohol 70% por los antebrazos.

Salvo que se tenga una buena práctica microbiológica, hay que evitar el flameado por el mechero de Bunsen (el alcohol es inflamable) sustituyendo la desinfección de los instrumentos por la inmersión en alcohol o hipoclorito de sodio (agua sanitaria, lavandina, lejía o agua jano, según su denominación en distintos países).

Antes de iniciar los procedimientos, recogerse el cabello además de quitarse relojes o anillos. Una buena organización del lugar de trabajo es determinante para el éxito de las actividades.

Durante los procedimientos, usar guantes descartables sobre los cuales eventualmente se pasará alcohol y una máscara quirúrgica y, fundamentalmente no hablar ni pasar los brazos sobre los explantes o por encima de los frascos abiertos que contienen medio. Evitar también abrir y cerrar las puertas y la circulación de personas en el laboratorio.

Todo el material contaminado será esterilizado y posteriormente, eliminado.

Primer objetivo: establecer un cultivo aséptico

Los pasos necesarios son los siguientes:

Obtención de los explantes

Limpiar cuidadosamente con agua y jabón el material elegido (hojas, tallos, raíces, etc.) dando preferencia a las partes jóvenes y saludables.

Desinfección de la superficie del explante

Sumergir el material retirado de la planta madre en etanol 70%, durante uno a dos minutos, antes de desinfectarlo con un agente químico como el hipoclorito de sodio (NaClO con 0,5-1% de principio activo) en solución, a la que se agregará una gota de detergente.

La concentración de la solución de hipoclorito y el tiempo necesario para la desinfección varía con el tipo de explante. La función del detergente es disminuir la tensión superficial, favoreciendo el contacto entre el explante y el desinfectante. La agitación suave y continua durante el proceso cumple la misma función.

El hipoclorito de sodio será eliminado mediante tres lavados con agua destilada estéril. A continuación, puede ser necesaria una disección en condiciones asépticas para eliminar las partes dañadas de los explantes.

Transferencia al medio de cultivo

El medio de cultivo puede estar distribuido en tubos de ensayo, en placas de Petri o en frascos de diverso tamaño. Transferir los explantes en condiciones asépticas, semejantes a las utilizadas para el cultivo de microorganismos.

Debido a la composición del medio, ni la humedad ni la disponibilidad de agua son factores limitantes. Para garantizar la aireación del cultivo y una buena oxigenación, se sustituyen las tapas de los frascos y se los cierra con film extensible de PVC (para uso alimentar).

Figura 3. Sustitución de las tapas por film de PVC.

Incubación

En temperatura entre 23 y 28 grados Celsius, con luz durante 12 a 14 horas diarias o en la oscuridad, dependiendo del explante.

Segundo objetivo: regenerar una planta

Una vez dominada la técnica para el establecimiento de cultivos asépticos, los tres próximos pasos para regenerar una planta son la multiplicación de los propágulos, la preparación de las plántulas para la transferencia a tierra y la aclimatación.

Multiplicación

Al observarse crecimiento y propagación, dividir el material y transferirlo a un medio fresco, de modo de obtener numerosos subcultivos. En algunos casos, basta alterar la composición del medio para estimular la diferenciación. Siempre en condiciones asépticas.

Preparación de las plántulas para la transferencia a tierra

En condiciones asépticas, transferir las plántulas de los subcultivos a un medio de enraizamiento donde, además de desarrollar las raíces, se fortalecerá y comenzará a fotosintetizar. En algunos casos se elimina el azúcar del medio.

Aclimatación

Cuando el desarrollo de la planta justifica su traspaso a tierra, se elimina el agar y los restos de azúcar por lavado. Se transfiere la planta primero a tierra o a algún otro sustrato, más tarde a un ambiente protegido. Protegidas de la iluminación solar directa, aumentarán su capacidad fotosintética adaptándose lentamente a las condiciones ambientales.

¿VALE LA PENA?

Por supuesto!

BIBLIOGRAFIA BÁSICA

DODDS J.H E ROBERTS L.W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge, Cambridge University Press, 1995.

FAO – FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION / IAEA -INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY

HOME TISSUE CULTURE GROUP.

KYTE L. E KLEYN J. Plants from test tubes – 3th edition. Portland, Timber Press Inc., 2009.

MALAJOVICH M.A.M. Trabajar en condiciones seguras.

MANTELL S.H., MATTHEWS J.A. E McKEE R.A. Princípios de biotecnologia em plantas. Ribeirão Preto, Sociedade Brasileira de Genética, 1994.

PIERIK R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990.

RAVEN, et al. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 2001.

SMITH R.A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, National Association of Biology Teachers, 1997.

TORRES A.C. ET AL. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Vol.1. Brasília, EMBRAPA-CNPH, 1998.

AGRADECIMENTOS

A los técnicos y alumnos que colaboraron en la preparación y el montaje de los experimentos de micropropagación.

Los medios de cultivo para micropropagación vegetal incluyen agua, una fuente de carbono, compuestos inorgánicos (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del crecimiento. Generalmente, el pH del medio es mantenido entre 5,0 y 6,5.

¿CUÁL ES EL ROL DE CADA COMPONENTE?

Agua destilada: Representa el 95% del medio nutritivo.

Fuente de carbono: Generalmente se utiliza sacarosa. La fuente de carbono es necesaria porque los explantes no son totalmente autotróficos y la fotosíntesis in vitro no aporta las necesidades de las células.

Compuestos inorgánicos: Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción que depende de la planta elegida.

Vitaminas: Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6 (piridoxina), pantotenato de calcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico y vitamina E (tocoferol).

Hormonas y reguladores de crecimiento

- Auxinas: Estas promueven el elongación celular, la formación de callos y de raíces adventicias; inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, la embriogénesis en suspensiones celulares. Ejemplos: IAA (ácido indol acético), NAA (ácido naftalenoacético), IBA (ácidoindolbutírico), 2,4 D(2,4- diclorofenoxiacético).

- Citocininas: Estas promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Ejemplos: cinetina, 2iP (2- isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), ceatina.

Otros compuestos: giberelinas, ácido abcísico, etileno, etc.

Mezclas de compuestos poco definidos: Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales, hidrolizados de caseína, peptona y triptona. La tendencia actual en investigación es la de sustituirlos por medios de composición definida.

Materiales inertes: Utilizados como soporte. Ejemplos: agar, agarosa, otros polisacáridos (Gelrite, Phytagel), lana de vidrio, papel de filtro, arena, esponjas de poliestireno.

DIFERENTES FORMULACIONES

Existen diferentes formulaciones, desde las más sofisticadas a las más simples, siendo la más antigua la solución de Knop, que incluso hoy en día es utilizada como base para los estudios sobre los macronutrientes necesarios para las plantas. Actualmente, se admite que la composición de un medio debe estar ajustada a las necesidades de cada especie.

Uno de los medios más utilizados es el de Murashige & Skoog (M&S), una mezcla compleja de sales complementada con vitaminas, a la cual se agrega sacarosa y agar. Por ser bastante concentrado, a veces se usa en una dilución del 50%. Su preparación figura en la siguiente.

El crecimiento y la diferenciación celular son controlados in vitro mediante modificaciones de las proporciones de hormonas y reguladores de crecimiento. De un modo general, si la proporción entre citocininas y auxinas es mayor que 1, se desarrollan brotes, si es menor, raíces, y si son iguales, callos.

Sin embargo, la necesidad de utilizar medios bien definidos se aplica fundamentalmente a la investigación científica. Para el horticultor o para el docente dicha necesidad es menor, y en muchos casos, los medios alternativos son suficientes para obtener buenos resultados.

Algunos autores (Taji, Bridgen) diseñaron medios alternativos de composición simple: fertilizante NPK 10:10:10 y vitaminas. En el laboratorio de enseñanza, tuvimos buenos resultados con el medio de Taji. La información sobre su preparación se encuentra en la Guía correspondiente.

La sacarosa puede ser reemplazada por azúcar cristal, en una concentración de 2 a 3%. El medio solidifica con agar bacteriológico en una concentración de 0,6 a 0,8%. También se puede experimentar con otros materiales (almidón, bolitas de vidrio, compost, papel de filtro, arena, etc.).

Con excepción de la hormona de enraizamiento que es barata y fácil de encontrar en los viveros, el precio de la mayoría de los factores de crecimiento es muy alto para un laboratorio de enseñanza e inclusive para algunos laboratorios comerciales. Una posibilidad es la adición de agua de coco a los medios, porque contiene reguladores del crecimiento análogos a la cinetina, que estimulan la división celular.

Además del agua de coco, otras sustancias de origen vegetal interesantes son la pulpa de banana y los jugos de tomate, naranja, uva y piña. Poco empleadas en la investigación científica, estas sustancias alternativas de composición mal definida sustituyen, en el laboratorio de enseñanza, algunos reactivos caros o de difícil obtención.

En Brasil, el agua de coco es un producto barato y fácil de encontrar, de modo que puede ser incluido habitualmente en el medio para estimular el crecimiento de los explantes. Para inducir la embriogénesis o la organogénesis del explante, se reemplaza el agua de coco por un volumen equivalente de agua destilada.

15. MEDIOS DE CULTIVO CLÁSICOS

En función de su complejidad, los medios para el cultivo in vitro de tejidos vegetales pueden resultar atemorizantes para el principiante. Con algunas variaciones, los medios más usados son los siguientes: Murashige & Skoog (1962), White (1963), Gamborg (1968), Nitsch (1951) y Knop (1865).

No obstante, la necesidad de utilizar medios bien definidos se aplica fundamentalmente a la investigación científica. Para el horticultor o para el docente dicha necesidad es menor y, en muchos casos, los medios alternativos son suficientes para obtener buenos resultados.

MEDIO DE MURASHIGE & SKOOG

De acuerdo con el fabricante (Sigma), el medio basal de Murashige y Skoog M5524 contiene los macro y micronutrientes de la fórmula clásica original. Puede ser complementado con vitaminas, sacarosa, agar, auxinas (IAA) y citocininas de modo de generar un medio completo para el crecimiento de los cultivos de tejidos vegetales.

La formulación demanda 4,3 g de polvo por litro de agua destilada, a la cual se agregan 10-50 g de sacarosa y 6-8 g de agar bacteriológico.

Preparación (100ml)

1. Pesar 0,43 g de medio M&S y disolver en 90 ml de agua destilada.

2. Agregar 2,5 g de sacarosa o de azúcar cristal.

3. Agregar 0,7 g de agar bacteriológico y calentar hasta que fundir (*).

4. Llevar a un volumen de 100 ml y mezclar bien.

5. Colocar en los frascos una capa de 2 cm de profundidad.

6. Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión (20 a 25 minutos contados a partir del momento en que la válvula deja escapar vapor).

(*) El agar funde cuando la temperatura pasa de 90 grados Celsius y solidifica cuando la temperatura baja de 50 grados Celsius.

VARIACIONES DEL MEDIO DE MURASHIGE & SKOOG

Medio de M&S con la mitad de la concentración

Por ser un medio rico en sales, el medio de M&S puede ser utilizado con la mitad de la concentración anterior. En este caso la formulación requiere 0,27 g de medio M&S en 100 ml de agua destilada, manteniendo las mismas cantidades de sacarosa o azúcar cristal y agar.

Medio de M&S complementado con agua de coco

Preparación del agua de coco

Extraer, mezclar y filtrar el agua de 3 cocos verdes. Después de separarla en alícuotas, guardarlas en el congelador hasta el momento de su uso.

Preparación de medio M&S con agua de coco (100ml)

1. Pesar 0,43 g de medio M&S y disolver en 40 ml de agua destilada.

2. Agregar 2,5 g de sacarosa o de azúcar cristal.

3. Agregar 0,7 g de agar bacteriológico y calentar hasta fundir (*).

4. Llevar a un volumen de 50 ml y mezclar bien.

5. Agregar 50 ml de agua de coco y mezclar bien.

6. Colocar en los frascos una capa de 2 cm de profundidad.

7. Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión (20 a 25 minutos contados a partir del momento en que la válvula deja escapar vapor).

(*) El agar funde cuando la temperatura pasa de 90 grados Celsius y solidifica cuando la temperatura baja de 50 grados Celsius.

Observación: Otras sustancias de origen vegetal interesantes son el agua de coco, la pulpa de banana y los jugos de tomate, naranja, uva y ananá (piña).

16. MEDIOS DE CULTIVO ALTERNATIVOS

En función de su complejidad, los medios para el cultivo in vitro de tejidos vegetales pueden resultar atemorizantes para el principiante. No obstante, la necesidad de utilizar medios bien definidos se aplica fundamentalmente a la investigación científica. Para el horticultor o para el docente dicha necesidad es menor y, en muchos casos, los medios alternativos son suficientes para obtener buenos resultados.

A pesar de utilizar últimamente el medio M&S comercial, nuestros primeros trabajos fueron realizados con medios alternativos simples y económicos, como el medio del Profesor Acram Taji (1996), cuya composición deriva del medio de Bridgen (1986). El agregado de agua de coco nos permitió sustituir, hasta cierto punto, los factores de crecimiento.

MEDIO DE COCO

Este fue el primer medio que utilizamos, con éxito, para cultivar callos de zanahoria.

Preparación de agua de coco

Extraer, mezclar y filtrar el agua de 3 cocos verdes. Después de separarla en alícuotas, guardarlas en el congelador (freezer) hasta el momento de uso.

Composición del medio de coco

50 ml de agua de coco

50 ml de agua destilada

1 a 5 g de azúcar cristal

0,7 g de agar

Preparación del medio

Disolver el azúcar y el agar en 50 ml de agua destilada.
Calentar el medio hasta que el agar funda (*).
Agregar 50 ml de agua de coco y mezclar bien.
Colocar en los frascos una capa de 1 a 2 cm de profundidad.
Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión durante 25 minutos, contados a partir del momento en que la válvula deja escapar vapor.

MEDIO DEL PROFESOR ACRAM TAJI

Este medio, también adoptado por el grupo de los “Home Gardeners”, difiere del medio original de Bridgen en la concentración de sales, mayor en el medio Taji. La gran ventaja es que todos los productos que entran en la composición pueden ser encontrados en farmacias y comercios de plantas.

Medio Taji básico

Composición

2 vasos de agua de lluvia (o agua destilada)

1⁄4 de vaso de azúcar

1 vaso de una solución de sales minerales (1/2 cuchara sopera de fertilizante NPK

10:10:10 disuelto en 1 litro de agua)

1⁄2 tableta de 500 mg de inositol.

1⁄2 tableta multivitamínica con tiamina (o vitamina B en gotas).

4 cucharadas de sopa de copos de agar (o agar bacteriológico en una concentración de 0,7 a 0,8%).

Preparación

Mezclar los componentes del medio y, antes de agregar el agar, verificar el valor del pH que debe estar entre 5 y 6. Si fuera necesario, ajustar el pH con ácido cítrico o con bicarbonato de sodio.

Calentar el medio junto con el agar hasta que esté derretido (*) y colocar en los frascos una capa de 2 cm de profundidad. Cerrar los frascos y esterilizar en la olla a presión durante 25 minutos, contados a partir del momento en que la válvula deja escapar vapor.

(*) El agar funde cuando la temperatura pasa de 90 grados Celsius y solidifica cuando la temperatura baja de 50 grados Celsius.

Medio Taji para multiplicación

Agregar al medio básico Taji 1⁄2 vaso de agua de coco y 1⁄2 cucharada (tamaño té) de malta. Mediante la sustitución del coco por 1⁄2 vaso de puré de tomate verde o de jugo de naranja recién exprimido, se obtendrán diferentes respuestas. Preparar los frascos como se ha indicado anteriormente.

BIBLIOGRAFÍA

HORTICULTURAL SCIENCE & PLANT BIOTECHNOLOGY GROUP

17. LA DESINFECCIÓN DE LOS INSTRUMENTOS

Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales consisten en la transferencia de un explante a un medio de cultivo estéril, en condiciones asépticas. Evitar la contaminación microbiana del medio de cultivo es una de las mayores dificultades técnicas, porque demanda tanto la desinfección de los explantes como la esterilización de los instrumentos utilizados.

Los cuchillos y las pinzas envueltos en papel de aluminio deben esterilizarse mediante calor húmedo (autoclave, 25 minutos en olla a presión), o mediante calor seco (en el horno, 3 horas a 360 grados Celsius). La elección de un método u otro depende de la presencia de partes de plástico que pueden derretirse con el calor excesivo.

Otra posibilidad es reutilizar los instrumentos, una vez desinfectados adecuadamente por inmersión en una solución con hipoclorito de sodio, alcohol o agua oxigenada. Como las concentraciones de esos productos pueden variar en función de las condiciones de almacenamiento y no todos son eficientes en la eliminación de esporas bacterianas, consideramos indispensable investigar la desinfección de los instrumentos antes de comenzar a trabajar con cultivos de tejidos.

OBJETIVO

Comparar la eficiencia de los desinfectantes usuales de laboratorio, en la limpieza de los instrumentos que serán utilizados en los cultivos de tejidos vegetales.

MATERIALES

Dos placas de Petri con agar nutritivo estéril, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Bacillus subtilis, 1 tubo con caldo nutritivo inoculado con Escherichia coli, 2 pinzas esterilizadas previamente por calor húmedo o seco, dos vasos de precipitados con el desinfectante a evaluar (uno para B. subtilis, otro para E.coli).

PROCEDIMIENTO

Seguir las normas de trabajo standard (Ver Guía Nº 67: trabajar en condiciones seguras).

1. Dividir la placa de Petri en 3 sectores, como se indica en el esquema adyacente (Control, 1 y 2).

2. Con la pinza estéril, hacer un trazo en el sector C.

3. Mojar la punta de la pinza en el cultivo de Escherichia coli y hacer un trazo en el sector 1.

4. Dejar la pinza en uno de los vasos de precipitados con desinfectante, durante 15 minutos.

5. Retirar la pinza, dejando escurrir el exceso de líquido, y hacer un trazo en el sector 2.

6. Repetir el procedimiento anterior en la segunda placa, con otra pinza estéril, el otro vaso de precipitados con desinfectante y el cultivo de Bacillus subtilis.

7. Incubar ambas placas a temperatura ambiente, hasta que el crecimiento bacteriano en el sector 1 sea evidente.

8. Analizar los resultados.

NUESTRO COMENTARIO

En función de la limitación de material y del alto número de contaminaciones que ocurren en el laboratorio de enseñanza, investigamos la eficiencia de varios desinfectantes con Escherichia coli y con Bacillus subtilis, una bacteria que esporula.

Los desinfectantes elegidos fueron los de uso habitual: soluión de hipoclorito de sodio (água sanitária, marca Globo), agua oxigenada 30%, etanol 92,8%, etanol 70% y CLOR-in 10 (dicloroisocianurato de sodio). Se adaptó el procedimiento detallado anteriormente a cada desinfectante, como se indica a continuación:

Solución de hipoclorito de sodio

Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua sanitaria 50% (v/v) durante 20 minutos y posterior enjuague en una solución de agua sanitaria 5% (v/v).

La concentración puede parecer muy alta, especialmente en relación con aquellas recomendadas en los protocolos de autores ingleses y norteamericanos. En sus países, la concentración normal del hipoclorito de sodio comercial es del 5%. En Brasil esa concentración es del 2 a 2,5%, de modo que adaptamos las recomendaciones de esos autores a nuestras condiciones. Aclaración: água sanitária es el nombre comercial de la solución de hipoclorito de sodio en Brasil. En Argentina y otros países, es llamada lavandina, lejía en España y agua jano en Chile. En Argentina la concentración de la lavandina es del 5%.

Agua oxigenada

Inmersión de la pinza contaminada en una solución de agua oxigenada 3% (v/v) durante 20 minutos.

3. Etanol (92,8% y 70%)

Inmersión de la pinza contaminada en etanol 92,8% o en etanol 70%, durante 20 minutos.

4. Clor-in 10 (Purificador de agua)

Inmersión de la pinza contaminada en una solución de Clor-in 10 (1 tableta/500 ml) durante 20 minutos.

Paralelamente, se realizó un control con agua destilada estéril (tiempo de inmersión, 20 minutos).

RESULTADOS

Los resultados esperados eran los siguientes:

Sector C: sin crecimiento microbiano a lo largo del trazo hecho con la pinza (Control del test de esterilidad)

Sector 1: crecimiento de las bacterias inoculadas (Escherichia coli o Bacillus subtilis)

Sector 2: el crecimiento bacteriano indicaría la ineficiencia del desinfectante utilizado; la ausencia de crecimiento mostraría su eficiencia.

Los resultados encontrados se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 1. Los mejores desinfectantes fueron la solución de hipoclorito de sodio (“água sanitária”), el agua oxigenada y el Clor-in 10. Ninguna de las dos concentraciones de etanol mostró ser eficiente en relación con Bacillus subtilis.

18. LA DESINFECCIÓN DE LOS EXPLANTES

Uno de los pasos más críticos en las técnicas de cultivo in vitro es la desinfección de los explantes, que comienza con un buen lavado con agua y jabón o detergente. Una vez que el explante está bien limpio, se procede a la desinfección con agentes químicos.

Los más económicos y fáciles de usar son el alcohol 70% y el hipoclorito de sodio, vendido comercialmente como agua sanitaria en Brasil, lavandina en Argentina, y lejía o agua jano en Chile y otros países latinoamericanos.

Una inmersión de 1 a 2 minutos en alcohol 70% permite eliminar burbujas de aire y disolver la capa epicuticular de los explantes, pero no garantiza la esterilización del explante. Esa es la función del agua sanitaria.

En muchos países la concentración del principio activo (NaClO) del agua sanitaria es del 5%, y los protocolos correspondientes recomiendan utilizar diluciones de 10 a 20 % (v/v). En Brasil, donde la legislación determina que la concentración del principio activo (NaClO) del agua sanitaria sea del 1,5 a 2%, la dilución equivalente para la desinfección del explante se encuentra entre el 25 y 50%.

Nosotros preferimos fijar en 50% la concentración de la solución desinfectante del agua sanitaria y modificar el tiempo de inmersión en función del tipo de explante. Como medida adicional, la solución desinfectante se prepara en un frasco estéril. Vale la pena destacar que una desinfección externa bien realizada no elimina las contaminaciones internas, que pueden aparecer días más tarde del sembrado del explante.

Una vez desinfectado el explante, se retira el hipoclorito mediante tres lavados sucesivos con agua destilada estéril. La duración de los lavados es de 1, 3 y 5 minutos, pudiendo en el último lavado permanecer por más tiempo. Para el lavado existen dos técnicas, cuya elección depende del tamaño y del número de explantes a esterilizar. La primera consiste en retirar el material y transferirlo a los recipientes con agua destilada estéril, un procedimiento práctico si el número de explantes es pequeño (Figura 1).

La segunda es abrir ligeramente el frasco para descartar el líquido, desechando el contenido en una pileta o en un balde de descarte (Figura 2). Antes y después de este procedimiento, se recomienda limpiar cuidadosamente la tapa y el exterior del frasco de alcohol. Esta última es nuestra preferida.

Si fuera necesario cortar el material o eliminar las partes quemadas por el hipoclorito de sodio, prever la esterilización de los instrumentos y de una caja de Petri conteniendo una hoja de papel toalla donde se realizará la disección.

Figura 1. Técnica para desinfectar los explantes.

NUESTRO COMENTARIO

La preparación de numerosos frascos de agua destilada estéril consume mucho tiempo, de modo que probamos reemplazarla en los lavados por una solución de Clor-in 10 (Dicloro isocianurato de sodio o NaDCC), un producto que se vende en los comercios locales para desinfectar utensilios y legumbres, en la concentración y tiempo indicados por el fabricante.

El Clor-in puede prepararse en el momento y no precisa enjuague. El mayor inconveniente es que el material queda un poco pegajoso y eso puede dificultar la transferencia de los explantes con la pinza a los tubos de ensayo.

En función de nuestra experiencia, vale la pena destacar que los ensayos de reinfección de explantes sólo con Clor-in 10, sin utilizar agua sanitaria, sólo dan resultados aceptables cuando el medio de cultivo no contiene sacarosa.

Para reducir las contaminaciones bacterianas y fúngicas, algunos autores recomiendan agregar NaDCC o Nipagin (metilparabeno) al medio de cultivo ya esterilizado. Sin embargo, no encontramos información clara sobre las concentraciones utilizadas y preferimos probar el uso de dichos productos en el lavado de los explantes.