educbiotecnologia - Agentes biológicos

01. A LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae

Conhecido como levedura, levedo de cerveja ou fermento biológico, o fungo Saccharomyces cerevisiae é utilizado na preparação de alimentos (pão, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produção de outras substâncias de importância industrial (etanol, vitaminas e outros metabólitos).

A levedura cresce facilmente em condições de laboratório e também pode ser manipulada geneticamente. Multiplica-se rapidamente em fermentadores ou biorreatores industriais, a partir de matérias-primas de baixo custo dos quais pode ser separada por filtração ou centrifugação, uma vez acabado o processo. Com 12.000.000 de pares de bases e 6.000 genes em 16 cromossomos, Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucarioto a ter o seu genoma sequenciado.

Respiração e fermentação

Na presença de oxigênio (aerobiose), as leveduras respiram, degradando a glicose em água e dióxido de carbono. Na ausência de oxigênio (anaerobiose), as leveduras fermentam, degradando parcialmente a glicose em etanol e dióxido de carbono. Do ponto de vista energético, a respiração é mais eficiente que a fermentação

De que as leveduras precisam para poder crescer? Açúcar, amido ou proteína? Presença ou ausência de ar? Folhas ou frutos?

OBJETIVO: Observar o crescimento de uma população de leveduras (Saccharomyces cerevisiae), em diferentes condições.

MATERIAIS: Oito garrafas plásticas, açúcar, 1 cubo de caldo de carne, batata, levedura, fruta, folhas, balões, elásticos, material básico de laboratório.

PROCEDIMENTO

1. Preparar os seguintes meios, adequando as quantidades ao volume das garrafas disponíveis.

Solução de açúcar (60 g de açúcar em 300 ml de água); suspensão de amido (uma colher das de chá de maisena em 100 ml de água); Solução de proteína (meio cubo de caldo de carne preparado como indicado na embalagem e diluído até a metade em água); solução de proteína e açúcar (uma parte da solução de água com proteína para uma parte da solução de açúcar).

2. Preencher as garrafas, até a metade, como indicado:

Garrafa 1: água

Garrafa 2: solução de açúcar

Garrafa 3: solução de amido

Garrafa 4: solução de proteínas

Garrafa 5: solução de proteínas + açúcar

Garrafa 6: solução de proteínas + açúcar

Garrafa 7: solução de proteínas + frutas amassadas

Garrafa 8: solução de proteínas + folhas cortadas

3. Dissolver 1 g de levadura em cada garrafa.

4. Fechar a garrafa 6 com algodão.

5: Fechar as garrafas restantes com um balão ajustado com um elástico.

6. Registrar a aparência do meio em cada garrafa.

7. Incubar por uma semana a temperatura ambiente, registrando as observações.

8. Analisar e interpretar as observações.

NOSSO COMENTÁRIO

As leveduras podem utilizar outros açúcares, tais como a sacarose ou a frutose, mas não fermentam nem com lactose nem com amido. Tanto as matérias-primas amiláceas como as celulósicas devem ser degradadas, química ou enzimaticamente, até a obtenção de um açúcar fermentável.

Trata-se de uma atividade simples, fácil de montar, e que sempre faz sucesso entre os alunos. Apesar de sua simplicidade, permite descobertas interessantes. Pode ser um ponto de partida para outras explorações. Pode ser complementada com amostras de levedura comercial fresca e seca.

02. BIODIVERSIDADE MICROBIANA

O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogêneo de seres que vivem como células independentes ou como agregados celulares: bactérias, arqueas, protozoários, algas e fungos e, também, vírus. Salvo estes últimos, que estão na fronteira entre o vivo e o não vivo, os encontramos dentro dos três domínios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya.

Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns são procariontes, como as bactérias; outros eucariontes, como os protozoários, as algas e os fungos. Os aeróbios crescem se houver oxigênio, os anaeróbios, se não o houver. Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas até as profundezas dos oceanos. Mas há também parasitas que crescem à custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependência de outros seres vivos.

Os autótrofos sintetizam seus alimentos a partir de dióxido de carbono; os fotossintéticos utilizam a luz como fonte de energia; e os quimiossintéticos, algumas reações químicas inorgânicas. Os heterótrofos dependem das moléculas orgânicas elaboradas pelos autótrofos que absorvem ou ingerem.

O fato de mantê-los agrupados sob a denominação de microrganismos talvez obedeça menos a uma questão de semelhança que a razões práticas; já que os mesmos métodos básicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificação) podem ser aplicados, com pequenas variações, a esses grupos.

* Nutrição heterotrófica: o organismo se alimenta de moléculas orgânicas elaboradas por outros seres vivos por absorção (captação de nutrientes dissolvidos na água) ou ingestão (entrada de partículas de alimentos não dissolvidas).

** Nutrição autotrófica: o organismo produz seu próprio alimento a partir de substâncias inorgânicas e de uma fonte de energia. Os seres autotróficos podem realizar fotossíntese (para a qual a fonte de energia é a luz solar) ou quimiossíntese (para a qual a fonte de energia é uma reação química exotérmica).

*** A absorção permite a captação de nutrientes dissolvidos na água; a ingestão se refere às partículas de alimentos não dissolvidas.

OBJETIVO: Observar a diversidade de organismos que crescem em diferentes ambientes.

MATERIAIS

Microscópio, lupa, lâminas e lamínulas, conta-gotas, pinça de metal, agulhas. Atualmente é possível utilizar os celulares com substitutos do microscópio e da lupa .

10 frascos de vidro, filme de PVC (Rolopac), elásticos, fruta bem madura (banana, laranja, limão ou maça), 5 a 10 uvas bem maduras, água de poça, lago ou rio, feno ou grama, feijão, queijo, alface, pão, terra de jardim, maisena, pimenta do reino em grãos.

PROCEDIMENTO

1. Numerar os frascos e adicionar

Frasco 1: Fruta cortada.

Frasco 2: Uvas levemente esmagadas, com água suficiente para cobri-las.

Frasco 3: Água de poça, lago ou rio.

Frasco 4: Feno ou grama, em quantidade suficiente para cobrir o fundo do frasco, e 200 ml de água.

Frasco 5: Alguns feijões e 200 ml de água.

Frasco 6: Um pedaço de queijo.

Frasco 7: Algumas folhas de alface em um pouco de água.

Frasco 8: Um pedaço de pão amanhecido exposto ao ar por 24 horas, umedecido antes de cobrir.

Frasco 9: Cinco gramas de maisena misturadas a 95 gramas de solo adubado com água suficiente para ficar com uma consistência pastosa.

Frasco 10: Um grama de pimenta do reino em grão e 200 ml de água.

2. Cobrir os frascos com filme de PVC e deixá-los na sombra durante uma semana.

3. Descrever, desenhar e fotografar os organismos observados (macro e microscopicamente) em cada frasco considerando a cor, o tamanho e a aparência (felpuda, fofa, pulverulenta, lisa, áspera, brilhante, reluzente, opaca, compacta, esparsa, irregular).

4. Organizar o registro fotográfico dos organismos observados.

NOSSO COMENTÁRIO

Esta atividade é de uma riqueza incrível. Figura em vários textos publicados na década de 1960, que tiveram uma influência marcante na prática de ensino de muitos professores de Biologia (B.S.C.S. I.N.E.C. Biología, su enseñanza moderna. Buenos Aires, Editorial Estrada, 1970).

03. CONSTRUÇÃO DE MODELOS CELULARES

A célula é uma estrutura viva composta por diferentes subunidades.

No Brasil, os livros didáticos do Ensino Fundamental II contemplam a estrutura das células procariontes e eucariontes (animais e vegetais) e introduzem os seguintes termos: parede celular, membrana plasmática, núcleo, cromossomos, carioteca, citoplasma, citosol, centríolos, vacúolo, mitocôndrias, ribossomos, cloroplastos. A construção de modelos celulares é uma das maneiras de facilitar o aprendizado evitando o lado maçante da memorização.

OBJETIVO: Representar a estrutura celular e as diferentes subunidades.

MATERIAIS

Banho Maria entre 60 e 70 graus celsius, parafina gel (gel cristal ou duro)*, moldes de plástico, filme de PVC (Rolopac ou equivalente), ovos de codorna vazios, lã, linha do tipo perlé ou espaguetes, pimenta, plasticina de várias cores, balões, papel alumínio, limpadores de cachimbo, miçangas, etc.

*A parafina gel (Solgel) é vendida como material para fazer velas nos estabelecimentos comerciais de produtos para artesanato. A variedade transparente (gel cristal ou gel duro) mantém uma consistência flexível ao esfriar e pode ser desenformada. O material pode ser reaproveitado de um ano para outro.

PROCEDIMENTO

1. Escolher os materiais que serão utilizados na montagem do modelo, especificando qual a subunidade representada por cada elemento.

2. Derreter o gel no Banho Maria, entre 60 e 70 graus Celsius, sem mexer, para evitar a formação de bolhas. Manter o gel a essa temperatura durante o restante do procedimento.

3. Colocar uma camada de gel no molde e deixar esfriar.

4. Distribuir os elementos selecionados previamente para representar as subunidades.

5. Completar o preenchimento do molde com gel.

6. Deixar esfriar e desmoldar sobre o filme de PVC.

7. Embrulhar a célula com o filme de PVC.

NOSSO COMENTÁRIO

A inclusão nos livros de texto do sétimo ano (Ensino fundamental II) das subunidades celulares e suas funções nos levou a colocar esta atividade como forma lúdica de introduzir alguns termos e conteúdos. Contradizendo nossas expectativas os alunos adoraram a tarefa que pode se renovar ano a ano com novos materiais e novas ideias.

Existem outras versões na literatura em que o modelo celular, construído com gelatina e balas, se transforma no fim da aula em objeto de comilança. Descartamos essa aproximação que nos parece contraditória com o tempo dedicado a explicar o que é uma dieta saudável.

Modelos celulares montados por alunos do Sétimo Ano, sob a orientação da Professora Éllen Pombal e a assistência técnica de Alessandra Sor.

04. PREPARAÇÃO DE UMA MASSA DE MODELAR

A massa de modelar é um material interessante para a construção de modelos. Este protocolo permite obter uma massinha econômica e fácil de trabalhar que pode ser conservada vários dias na geladeira (Figura 1).

MATERIAIS

1 copo de farinha de trigo; 1/2 copo de sal; 1 colher de chá de cremor tártaro* (bitartarato de potássio); 1 copo de água; 1 colher de chá de óleo; corante alimentício.

* Utilizado como estabilizante em culinária e pode ser encontrado nas boas casas de temperos e outros produtos alimentícios. Não é indispensável.

PROCEDIMENTO

1. Peneirar todos os ingredientes e misturar com a água.

2. Acrescentar o corante e o óleo.

3. Levar ao fogo médio misturando sempre, até desgrudar da panela.

4. Deixar esfriar antes de embrulhar em saco plástico.

5. Conservar na geladeira até o momento de usar.

05. CONSTRUÇÃO DE MODELOS CELULARES EM ESCALA

A célula é uma estrutura viva composta por diferentes subunidades. A construção de um modelo celular deve levar em conta a forma e o tamanho de cada uma delas (Tabela 1). Por serem muito pequenas, tanto as células como as subunidades celulares são medidas em mícrones. O mícron é representado pelo símbolo µm.

1 µm = 10-6m = 10-3 mm

Na construção de modelos celulares é indispensável considerar a proporção existente entre o tamanho da célula e o tamanho das subunidades. A escala constitui um fator de multiplicação que aplicado a cada subunidade nos fornece o tamanho.

O THE CELL TOUR PROJECT) indica os seguintes valores para o tamanho médio real das estruturas celulares (µm):

Célula: 30 µm

Núcleo: 7,5 – 10 µm

Nucléolo: 2,5 µm

Mitocôndria: (3 – 10) x 1 µm

Lisossomo: 2 µm

Retículo endoplasmático: 0,5 µm de espessura (2 membranas de 0.009 µm com um compartimento de 0,03 µm entre ambas).

Complexo de Golgi: 1 x 1 µm (a espessura da membrana é a mesma que a do retículo endoplasmático)

Vacúolo central: Tamanho variável (50-80% do volume celular); 15 x 20 µm

Ribossomo: 0,025 µm

Cloroplasto: 5 x 2 µm

Lisossomos: 0,2 – 2 µm

Peroxissomos: 3 µm

Membrana plasmática: 0,009 µm de espessura

Parede celular: 1-2 µm de espessura

Microfilamentos (citoesqueleto): 0,7 x 0.007µm (diâmetro)

Microtúbulos (centríolo): 0.02 µm (diâmetro)

1. Construção de um modelo bidimensional

Se quisermos construir um modelo bidimensional, em uma folha de tamanho A4, a escala escolhida será 1 mícron = 0,5 cm. Considerando que o diâmetro da célula é de 30 µm, em nosso modelo o diâmetro será de 30 µm x 0,5 cm / µm = 15 cm

Para construir o modelo em uma folha de cartolina, utilizaremos outra escala como, por exemplo, 1 mícron = 1 cm. Neste caso, o diâmetro da célula será de 30 µm x 1 cm / µm = 30 cm

Em uma escala onde 1 mícron = 1,5 cm, o diâmetro da célula será de 45 cm.

O tamanho das organelas terá que ser calculado a partir da escala escolhida.

A escolha dos materiais fica a critério do/da Professor/a e seus alunos.

2. Construção de um modelo tridimensional

NOSSO COMENTÁRIO

Uma escala dez vezes maior (1 mícron = 5 cm) permite construir uma célula de 1,5 m de diâmetro. Como no caso anterior, o tamanho relativo de cada subunidade terá que ser calculado em função desta escala. A escolha dos materiais fica a critério do/da Professor/a e seus alunos.

Outra opção é a construção de uma célula em biscuit ou em massinha de modelar. A Figura mostra um modelo de célula animal em biscuit, montada por Joyce Sillero.

06. UM EXPERIMENTO SIMPLES DE DIFUSÃO

Todas as células estão rodeadas por uma membrana plasmática que permite o intercâmbio de substâncias com o meio ambiente. Os processos de difusão (transporte de um soluto) e de osmose (transporte do solvente) são fenômenos físicos devidos ao movimento espontâneo das moléculas do soluto ou do solvente através de uma membrana semipermeável. Ambos os processos tendem a igualar a concentração de uma substância dentro e fora da célula (Figura 1).

Gases (O2, CO2), água, sais, monossacarídeos e aminoácidos atravessam a membrana diretamente (difusão simples e osmose) ou por meio de proteínas transportadoras (difusão facilitada). Trata-se de um transporte passivo que não envolve gasto de energia.

Vários experimentos permitem evidenciar esses processos. Neste guia mostramos como abordar experimentalmente a difusão da molécula de iodo, utilizando elementos simples.

Figura 1: O transporte passivo de substâncias (difusão)

A membrana semipermeável permite a passagem das moléculas de soluto da região mais concentrada para a região menos concentrada, até alcançar um equilíbrio dinâmico.

OBJETIVO: Observar a passagem diferencial das moléculas de iodo e de amido através de uma película semipermeável inerte.

MATERIAIS

Solução coloidal de amido (1%) e reagente de Lugol, preparados como indicado no guia 07.

Filme de PVC (Rolopac ou equivalente), solução coloidal de amido (1%) e reagente de Lugol, preparados como indicado no guia 07, 1 azulejo, 2 conta-gotas, 2 béqueres, 2 elásticos, 2 palitos de churrasco.

PROCEDIMENTO

A. Identificação do amido

1. Colocar umas gotas de amido no azulejo.

2. Deixar cair uma gota do reativo de Lugol.

3. Observar a cor azul característica.

B. Experimento 1

1. Preparar um saquinho de filme de PVC com a solução coloidal de amido.

2. Fechá-lo com um elástico.

3. Pendurar o saquinho de um palito de churrasco e coloca-lo no béquer com o reagente de Lugol.

4. Observar a mudança de cor.

C. Experimento 2

Repetir o experimento anterior invertendo a posição da solução de amido e do reativo de Lugol.
Observar a mudança de cor.

D. Análise dos resultados

Comparar e interpretar as observações realizadas nos experimentos 1 e 2.

SOLUÇÃO DE IODO-IODETO DE POTÁSSIO (Reagente de Lugol). Em MORITA T., ASSUMPÇÃO ROSELY M.V. Manual de soluções, reagentes e solventes. São Paulo, Editora Edgar Blücher Ltda., 1972.

Solução concentrada: Dissolvem-se 10 g de iodeto de potássio (KI) e 5 g de iodo (I2) em 50 ml de água destilada e completa-se a 100 ml.

Solução para a identificação de amido e para a coloração de bactérias (Lugol de Gram)

1. Dissolvem-se 2 g de iodeto de potássio (KI) em 100 ml de água destilada.

2. Acrescentar 1 g de cristais de iodo.

3. Completar a 300 ml de água destilada.

Em presença do reagente de Lugol o amido adquire uma coloração azul característica. A hidrólise da molécula de amido libera dextrinas que, em presença de Lugol adquirem uma cor marrom-avermelhada.

OBSERVAÇÕES

Conservar em frasco de vidro âmbar ou em frasco recoberto com papel alumínio. Em experimentos simples o reativo de Lugol pode ser substituído por tintura de iodo, comprada na farmácia. Cuidado! Algumas pessoas são alérgicas ao iodo.

SOLUÇÃO COLOIDAL DE AMIDO (= GOMA DE AMIDO)

Preparação de uma goma de amido a 1%

1. Diluir 1 g de amido em 10 ml de água fria.

2. Verter em 90 ml de água fervendo.

3. Misturar e deixar ferver por 3 minutos.

4. Resfriar.

OBSERVAÇÕES

O amido é insolúvel na água fria, de modo que para se obtiver uma goma é indispensável seguir a risca todas as etapas indicadas no procedimento. No laboratório de ensino, a goma de amido pode ser preparada com maisena. A goma de amido deve ser preparada no momento, ou conservada no refrigerador por no mais de 24 a 48 horas.

A dispersão da luz pelas partículas de coloide (efeito Tyndall) pode ser observada fazendo atravessar dois béqueres com água e goma de amido pelo raio Laser emitido por uma lanterna (Figura 1).

08. UM EXPERIMENTO DE OSMOSE

Todas as células estão rodeadas por uma membrana plasmática que permite o intercâmbio de substâncias com o meio ambiente.

Os processos de difusão (transporte de um soluto) e de osmose (transporte do solvente) são fenômenos físicos devidos ao movimento espontâneo das moléculas do soluto ou do solvente através de uma membrana semipermeável. Ambos os processos tendem a igualar a concentração de uma substância dentro e fora da célula (Figura 1).

Gases (O2, CO2), água, sais, monossacarídeos e aminoácidos atravessam a membrana diretamente (difusão simples e osmose) ou por meio de proteínas transportadoras (difusão facilitada). Trata-se de um transporte passivo que não envolve gasto de energia.

Vários experimentos permitem evidenciar esses processos. Neste guia mostramos como abordar experimentalmente o fenômeno de osmose com pedaços de batata colocados em soluções de diferente concentração.

Figura 1: O transporte passivo de substâncias (Osmose)

A membrana não é permeável ao soluto. O solvente tende a passar da solução menos concentrada em soluto para a solução mais concentrada, até atingir um equilíbrio dinâmico em que a quantidade de água que passa para um lado é igual à que passa para o outro.

OBJETIVO: Estudar o comportamento de células de batata colocadas em meios com diferentes concentrações de sacarose.

MATERIAIS

300 ml de uma solução mãe de sacarose 1 mol/l (34,2 g de sacarose em 100 ml de água destilada), 1 proveta de 100 ml, 6 recipientes de 100 ml (béqueres, copos plásticos ou frascos de vidro), 1 ou 2 batatas inglesas, faca, azulejo, papel toalha, régua, toalha de papel.

PROCEDIMENTO

1. Rotular os recipientes.

2. Distribuir nos recipientes, primeiro a água e depois a solução de sacarose, como indicado:

RECIPIENTE 1 : 100 ml de água + 0 ml da solução-mãe de sacarose

RECIPIENTE 2 : 80 ml de água + 20 ml da solução-mãe de sacarose

RECIPIENTE 3 : 60 ml de água + 40 ml da solução-mãe de sacarose

RECIPIENTE 4 : 40 ml de água + 60 ml da solução-mãe de sacarose

RECIPIENTE 5 : 20 ml de água + 80 ml da solução-mãe de sacarose

RECIPIENTE 6 : 0 ml de água + 100ml da solução-mãe de sacarose

8. Representar graficamente a variação do comprimento V% em função da concentração da solução de sacarose.

9. Sabendo que a concentração da solução mãe de sacarose é de 1 mol/l, calcular a concentração de sacarose nas células de batata.

NOSSO COMENTÁRIO

Uma versão do experimento figura nos arquivos da NUFFIELD FOUNDATION. Trata-se de uma atividade clássica cuja principal fonte de erro reside na variabilidade do tamanho dos bastões de batata.

Uma alternativa possível é a preparação de cilindros com um furador de rolhas de laboratório ou com um fura-coco. Neste último caso o comprimento dos pedaços pode ser menor.

A inclusão de um corante alimentar na solução mãe permite aos alunos visualizar as diferenças de concentração.

A figura 1 mostra resultados obtidos em sala de aula por um grupo de alunos. As células de batata e a solução 20% (0,2 M) da solução-mãe de sacarose são isotônicas. Pode-se concluir que essa é a concentração de sacarose das células de batata.

Figura 1: Variação (%) do comprimento de bastões de batata imersos em soluções de sacarose de diferente concentração.

Células vegetais colocadas em um meio hipertónico sofrem uma retração do volume (plasmólise) em função da perda de água devida ao fenômeno de osmose. Em um meio hipotônico, essas células recuperam o volume inicial (deplasmólise), podendo inclusive ficar túrgidas (Figura 1).

Sendo a parede celular uma estrutura relativamente rígida, células vegetais colocadas em um meio hipotônico não sofrem líse. Contudo, a entrada de água está limitada pela pressão exercida pela parede celular.

OBJETIVO: Observar microscopicamente a plasmólise de células de cebola roxa.

MATERIAIS

Microscópio, lâminas, lamínulas, pinças, papel toalha, álcool, cebola roxa , sal ou açúcar.

Aparelhos fotográficos digitais fornecem boas imagens quando colocados no ocular do microscópio. Telefones celulares e aplicativos específicos podem, eventualmente, substituir o microscópio.

PROCEDIMENTO

1. Limpar cuidadosamente com álcool as lâminas e lamínulas que serão utilizadas.

2. Tirar uma camada de cebola e retirar com a pinça um fragmento de película da mesma. Estender esse fragmento em uma gota d’água, sobre uma lâmina.

3. Colocar a lamínula sobre o fragmento de tecido.

4. Observar as células ao microscópio.

Pôr um pouco de sal (ou de açúcar) na beira da lamínula. Aguardar uns minutos e observar novamente as células. O que aconteceu?

NOSSO COMENTÁRIO

Trata-se de uma atividade clássica de microscopia que não apresenta maiores dificuldades (Figura 2).

A cebola roxa permite evitar o uso de corantes, a condição de extrair a película da epiderme externa da escama, que é onde se encontram as células pigmentadas (antocianinas).

Com a cebola branca, a película é geralmente extraída da camada interna da escama do bulbo e se utilizam corantes (vermelho neutro, violeta de genciana etc.).

10. A EXTRAÇÃO DE DNA

Muitas pesquisas de Biologia Molecular começam com a extração de ácidos nucleicos. A lise celular libera as moléculas em uma fase aquosa que é separada dos restos celulares por centrifugação. As proteínas são removidas da fase aquosa por solventes orgânicos (fenol, clorofórmio). O DNA, que permanece na fase aquosa, é precipitado com etanol e, posteriormente, purificado e suspendido em um buffer adequado.

A existência de kits comerciais tem mudado a rotina de muitos laboratórios. Nos kits, os solventes orgânicos são substituídos por filtros que retém o DNA, em condições de concentração salina elevada. A eluição do DNA retido no filtro ocorre em baixa concentração salina.

A PRÁTICA NO LABORATÓRIO DE ENSINO

Por alguma razão que nos escapa, a extração de DNA é uma atividade que entusiasma a alguns e decepciona a outros. Provavelmente, as diferenças de opinião tenham mais a ver com a personalidade dos alunos e suas fantasias que com a atividade em si.

As etapas possíveis no laboratório de ensino são as seguintes:

1. Trituramento do tecido, para separar as células.

2. Lise das membranas celulares com detergente, em uma solução salina, para liberar os ácidos nucleicos e as proteínas.

3. Digestão das proteínas por ação enzimática de proteases (Opcional).

4. Precipitação com etanol gelado. O DNA é solúvel em álcool, mas torna-se insolúvel na presença de sal (NaCl), porque o sódio neutraliza a carga negativa dos grupos fosfatos. O etanol formará uma camada na superfície por ser menos denso que a solução aquosa.

5. Observação de agregados moleculares, de consistência mucoide, na interface entre a solução aquosa e o álcool.

Os agregados moleculares obtidos são uma mistura em proporção variável de ácidos nucleicos, proteínas e pectina, um carboidrato presente na lamela intercelular e no vacúolo das células vegetais.

OBJETIVO: Extrair DNA mediante um procedimento simples.

MATERIAIS

Um pacote de ervilha seca, sal grosso, detergente, água fria, liquidificador, coador, béquer, amaciante de carne com protease (papaína), etanol gelado, tubos de ensaio e grade (substituíveis por frascos pequenos ou copos), 1 pipeta ou proveta, vareta de madeira ou agulha de crochet.

O etanol deve ser colocado no congelador, em frasco fechado, pelo menos um dia antes da realização da prática.

PROCEDIMENTO

As membranas celulares e nucleares das células de ervilha são desagregadas com detergente, em solução salina, liberando os ácidos nucleicos que precipitam com a adição de etanol gelado.

1. Bater no liquidificador 100 ml de ervilha seca, uma pitada de sal grosso e 200 ml de água fria, por 15 a 20 segundos.

2. Coar a “sopa de ervilha rala” obtida anteriormente e descartar os restos de ervilha. Continuar o procedimento com a fração líquida filtrada.

3. Acrescentar 2 colheres, das de sopa, de detergente líquido. Misturar suavemente.

4. Aguardar 5 a 10 minutos. Durante esse tempo colocar em cada tubo, ou em cada frasco, uma pitada de amaciante de carne.

5. Distribuir a mistura nos tubos ou nos frascos (1/3 da capacidade do recipiente escolhido).

6. Acrescentar um volume equivalente de etanol 95 % gelado. Esta etapa é crítica, deve-se inclinar levemente o tubo e, muito devagar, deixar escorrer o etanol sobre o líquido de maneira a formar uma segunda camada por cima da mistura.

Aguardar 10 minutos sem misturar as camadas e observar o DNA que precipita na interface das duas e sobe até a superfície.

Retirar o DNA com uma vareta de madeira ou uma agulha de crochet.

NOSSO COMENTÁRIO

Este guia está baseado em dois textos:

MADDEN D. Discovering DNA. Science in School 1: Spring 2006.

GENETIC SCIENCE LEARNING CENTER. How to extract DNA from anything living.

De vários protocolos analisados e testados, o do Genetic Science Learning Center é o nosso preferido, porque além de apresentar um procedimento simples, utiliza como fonte de DNA um material barato, fácil de encontrar em qualquer época do ano.

Os primeiros protocolos de extração de DNA que foram desenvolvidos para serem aplicados em laboratórios de ensino, utilizavam fígado e timo como fonte de DNA. Com a disseminação da doença de Creutzfeldt-Jacob (doença da vaca louca), razões de biossegurança invalidaram o uso de órgãos animais, que foram substituídos por outras fontes, de origem vegetal. Contudo, as células e tecidos vegetais contém pectina, um polissacarídeo que precipita com etanol, assim como o DNA em solução salina.

Para diferenciar a pectina e o DNA nos agregados moleculares obtidos, investigou-se a presença do polissacarídeo na ervilha seca. Esta foi triturada e misturada com a quantidade de água prevista no protocolo. Uma vez coada obteve-se uma “sopa” rala, da qual foram separadas duas alíquotas.

A primeira foi misturada a uma quantidade igual de etanol, agitada e deixada em repouso para decantar. O teste do álcool para a determinação do teor de pectina deve ser interpretado como a seguir:

A aparição de um precipitado gelatinoso e firme é sinal de bastante pectina (+++).

Um precipitado mais ou menos gelatinoso, que se rompe por agitação leve, corresponde a um teor médio (++).

Um precipitado filamentoso granulado corresponde a um baixo teor de pectina (+).

Na segunda alíquota, acrescentaram-se o sal e o detergente para completar a extração do DNA segundo o protocolo. Os resultados podem ser vistos na Figura 1. A comparação entre ambas as fotos indica que os filamentos observados na imagem à direita seriam de DNA e não de pectina. A confirmação dependeria do resultado de um tratamento desses filamentos com DNAse, um teste que está fora de nossas possibilidades.

A AÇÃO DE DIFERENTES DETERGENTES

Muitos dos protocolos disponíveis recomendam o uso de SDS (dodecilsulfato sódico). Este não é um detergente usual, de modo que nos experimentos foram utilizados produtos do supermercado.

Comparou-se a eficiência de dois agentes detergentes: o lava louças Limp e o lava roupas Ariel líquido. Como este último contém enzimas (proteases, lipases e celulases), omitimos a adição de protease no procedimento correspondente.

A Figura 2 mostra a extração de DNA realizada satisfatoriamente com os dois produtos. Com Ariel, o resultado foi más rápido.

O TRATAMENTO COM CALOR

Outra recomendação encontrada nos protocolos que circulam na Internet é que a mistura “sopa” + sal + detergente seja colocada no banho Maria a 55-60 graus Celsius, de modo a inativar as enzimas presentes e favorecer a liberação do DNA. Em outros protocolos, a temperatura do banho é de 70 graus Celsius. Em todos eles, uma vez transcorridos 15 minutos exatos, a mistura deve ser transferida a um banho de gelo, para evitar a degradação do DNA. Esfriada a mistura, acrescenta-se a protease.

Os resultados da extração de DNA de ervilha seca com e sem tratamento com calor podem ser visualizados na Figura 3. O protocolo do GSLC (Genetic Science Learning Center), que não contempla o tratamento com calor, nos permitiu extrair DNA da ervilha. Acrescentando o tratamento com calor ao mesmo protocolo, obtiveram-se aglomerados gelatinosos de pectina.

A ervilha contém pectina. Uma extração rápida a temperatura ambiente libera DNA, mas uma extração mais demorada a uma temperatura alta (60 graus Celsius) durante 15 minutos provocaria a gelatinização da pectina, gerando a nuvem turva que se observa nas três repetições do experimento.

Em função dos resultados anteriores, não vemos nenhuma necessidade de complicar o procedimento. Para alcançar objetivos didáticos, o tratamento com calor resulta supérfluo. Com tratamento de calo

A OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA

Recomendada em vários protocolos e frequentemente solicitada pelos alunos, a observação microscópica dos filamentos resulta, obviamente, um fiasco. Nunca falta alguém que acredite poder ver a dupla hélice e não adianta falar em nanômetros. A decepção permanece.

MEDIDAS DE MASSA SECA

O DNA extraído pode ser colocado a secar em um papel de filtro ou em um pedaço de papel de alumínio. A massa pode ser calculada como

Massa (papel + DNA) – Massa (papel) = Massa DNA

A menos de contar com uma balança adequada, o procedimento de secagem e pesagem do DNA não subministra dados interessantes.

COMO MONTAR UM PROJETO

Comparar os resultados da extração de DNA de ervilha com os de outros grãos (lentilha, por exemplo).

Comparar os resultados da extração de DNA de ervilha seca, de ervilha congelada e de ervilha enlatada.

Comparar os resultados obtidos com diferentes proteases (suco de abacaxi, líquido para a limpeza de lentes de contato etc.).

Comparar os resultados obtidos quando se acrescenta a protease junto com o detergente.

Comparar a quantidade de DNA extraído a partir de diferentes fontes.

12. DNA, RNA E INFORMAÇÃO

OS ÁCIDOS NUCLEICOS

Embora descobertos em 1869, por Miescher, no pus das bandagens de ferimentos, o papel dos ácidos nucleicos na hereditariedade e no controle da atividade celular começou a ser esclarecido apenas em meados do século XX com a proposta de J. D. Watson e F. Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molécula de DNA.

A dupla hélice representa, sem dúvida, um marco fundamental na história da Biologia Molecular. Nas duas décadas seguintes foram esclarecidas as bases do código genético e os mecanismos de transmissão da informação dentro da célula.

No ensino de Biologia ou Ciências, aprofundar o tema significa dar aos alunos a possibilidade de entender e acompanhar os avanços posteriores da Biotecnologia.

Do ponto de vista químico, os ácidos nucleicos são macromoléculas formadas por unidades de nucleotídeos. Um nucleotídeo resulta da associação de três tipos de elementos: uma molécula de ácido fosfórico, um açúcar de cinco carbonos (ribose ou desoxirribose) e uma base nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina ou uracila. Mediante a ligação entre o ácido fosfórico de um nucleotídeo e a base nitrogenada de outro formam-se cadeias.

Nas células procarióticas, há uma molécula grande e circular de ácido desoxirribonucleico (DNA) compondo cromossomo e uma ou duas moléculas de DNA compõem estruturas circulares, denominadas plasmídeos. Nas células eucarióticas, várias moléculas lineares de DNA dentro do núcleo celular formam os cromossomos. Estes também são encontrados em cloroplastos e mitocôndrias.

Além do DNA, a célula conta com ácidos nucleicos em que o açúcar desoxirribose é substituído pela ribose. Seja no núcleo ou no citoplasma, os ácidos ribonucleicos (RNA) cumprem diversas funções, tanto na síntese de proteínas como na regulação da expressão dos genes. Neste texto só nos referiremos a um tipo de RNA, o RNA mensageiro (mRNA).

As ligações entre as bases ocorrem sempre do mesmo modo: a adenina (a) se liga à timina (t), e a citosina (c) à guanina (g).

Quando em uma fita a sequência de bases é agtacg, na outra fita ela será tcatgc.

A regra de complementariedade das bases (a-t e c-g) permite que cada fita sirva de molde para a síntese de uma nova molécula (Figura 2).

A autoduplicação do DNA permite que, no momento da divisão celular, cada uma das duas células filhas receba uma cópia do material genético, com as instruções necessárias para a construção e o funcionamento do indivíduo.

Pequenos erros na replicação do DNA introduzem mudanças na sequência e, por conseguinte, na informação genética.

Sua frequência aumenta em presença de alguns agentes químicos e físicos como a luz ultravioleta e os raios X.

A TRANSCRIÇÃO DA INFORMAÇÃO (do DNA ao mRNA)

O funcionamento de uma célula depende em grande parte das proteínas. Estas cumprem um papel fundamental para os seres vivos, seja como componentes estruturais, seja como substâncias de reserva. Também pertencem ao grupo das proteínas as enzimas, moléculas de ação catalítica, e os anticorpos, moléculas que participam na defesa do organismo.

As proteínas estão formadas por 20 aminoácidos diferentes. A união de vários aminoácidos forma uma cadeia peptídica que se caracteriza não só pelo número e tipo de aminoácidos que a compõem, como pela sequência em que estes se encontram. Dessa estrutura dependerá a configuração espacial da molécula e sua função.

Como pode um segmento de DNA determinar a sequência de uma proteína? O código é simples, a cada trinca de bases corresponde um aminoácido. Mudanças na sequência de bases do DNA podem ter como consequência a substituição de um aminoácido por outro.

A célula liga e desliga os genes de acordo com suas necessidades. Quando um gene é ativado a informação não passa diretamente do DNA aos aminoácidos, sendo necessária a intervenção de um intermediário, que é o RNA mensageiro (mRNA). Observe-se que, além da diferença já citada em relação ao açúcar, o mRNA é uma molécula de fita única e de comprimento menor ao do DNA.

A TRADUÇÃO DA INFORMAÇÃO (do mRNA à proteína)

A tradução da linguagem dos ácidos nucleicos à linguagem das proteínas permite a montagem da cadeia de aminoácidos na ordem certa. Deste modo, se estabelece na célula um fluxo da informação genética que segue em uma direção única: do DNA ao RNA, do RNA ao peptídeo.

Uma exceção a esta regra são os retrovírus, cujo material hereditário é RNA, porque contam com uma enzima (transcriptase reversa) que lhes permite transcrever a informação no sentido RNA-DNA.

A tabela nos mostra quais os aminoácidos correspondentes aos diferentes códons ou trincas de bases do mRNA. Alguns são codificados por uma única trinca, como o triptofano (ugg) ou a metionina (aug); outros admitem vários códons que geram sinonímia como, por exemplo, a prolina (ccu, ccc, cca, ccg).

O início da sequência é sinalizado por aug, o códon correspondente a metionina, sendo este aminoácido removido posteriormente. O fim da sequência é sinalizado por uaa, uag ou uga, três códons que significam stop, assim como em nossa linguagem o ponto representa o fim de uma frase. Nenhuma das duas situações está representada no exemplo das figuras, os primeiros aminoácidos da beta globina humana cuja sequência é VHLTPEE (Figura 4).

Mudanças na sequência de bases do DNA podem ter como consequência a substituição de um aminoácido por outro. Na beta globina humana, se gug for substituído por cgu, no peptídeo correspondente a valina será substituído por leucina. Mas, em função da sinonímia do código, se a trinca gug for substituída por gua ou guc, o aminoácido codificado continuará sendo a valina. Perdas ou adições de uma base modificam o resto da sequência do peptídeo.

As mutações de ponto são essas pequenas mudanças da sequência, devidas a erros na duplicação do DNA. Sua frequência aumenta em presença de alguns agentes químicos e físicos como a luz ultravioleta e os raios X.

PODE UM GENE CODIFICAR VÁRIOS POLIPEPTIDEOS?

Contrariamente à visão tradicional que considerava o gene como uma sequência de DNA codificadora de um único polipeptídeo, hoje sabemos que a grande maioria dos genes humanos pode codificar vários polipeptídeos.

Mecanismos nucleares de corte e reunião do transcrito podem originar diversos mRNAs que são traduzidos como peptídeos diferentes. Isto explicaria por que aproximadamente 20.000 genes seriam suficientes para codificar o genoma de um ser humano.

QUAL É A PERCENTAGEM DE DNA QUE CODIFICA POLIPEPTÍDEOS?

As sequências codificadoras de polipeptídeos correspondem, aproximadamente, a 1,5% do genoma nuclear. No DNA restante, mal chamado de “lixo”, se encontram diversos tipos de sequências cuja função ainda está sendo estudada.

13. DNA, RNA E INFORMAÇÃO: APLICAÇÃO

Neste guia de atividades o/a Professor/a encontrará um modelo para armar ilustrando diversos aspectos relacionados com o fluxo da informação genética.

Este modelo permite representar a replicação da informação genética (DNA–DNA) assim como o seu fluxo em duas etapas: a transcrição (DNA-RNA) e a tradução (RNA-peptídeo). Também possibilita abordar a mutação gênica e a síntese artificial de DNA.

O modelo consta de 3 folhas com nucleotídeos de DNA (30 adeninas, 30 timinas, 30 citosinas e 30 guaninas) para representar a replicação do DNA. Para mostrar a transcrição e a tradução da sequência apresentada basta acrescentar 1 folha com nucleotídeos do RNA (10 adeninas, 10 uracilas, 10 citosinas e 10 guaninas) e outra com os 20 aminoácidos.

Dependendo do número de alunos e do plano de aula do/a Professor/a o número de peças terá que ser ajustado.

O esqueleto de açúcar-fosfato não se encontra aqui representado, mas pode ser acrescentado facilmente com palitos de churrasco, duas réguas ou tiras finas de cartolina.

Dirigidas ao aluno, as quatro folhas para colorir são uma opção complementar para a fixação do aprendizado.

Os roteiros de trabalho foram elaborados sobre a sequência gênica correspondente aos primeiros aminoácidos da cadeia de beta-globina humana, um dos componentes da hemoglobina (HbA). As respostas da maioria das perguntas se encontram em vermelho.

Instruções gerais

Imprimir as folhas em papel com alguma gramatura.

Cortar as peças de nucleotídeos de DNA e de RNA pelas bordas.

Cortar as peças de aminoácidos seguindo as linhas externas (retângulo).

Guardar separadamente em frascos ou envelopes.

Bibliografia: Esta atividade está montada sobre a sequência dos primeiros aminoácidos da cadeia de beta-globina humana, um dos componentes da hemoglobina (HbA), encontrada no National Center of Biotechnology Information, acessado durante o mês de maio 2014.

2. Separar ambas as fitas e construir a fita complementar de cada uma delas, como indicado na figura 2 do texto acima.

3. Comparar a sequência das bases na molécula-mãe e nas moléculas filhas.

4. Na folha correspondente colorir com cores diferentes as fitas originais da molécula-mãe e as fitas recentemente sintetizadas. Cada uma das moléculas filhas estará formada por fitas de cores diferentes (duplicação semiconservativa).

5. Discutir a importância deste processo na transmissão da informação genética de uma célula a outra.

ROTEIRO 2. A TRANSCRIÇÃO DA INFORMAÇÃO (DNA ----> mRNA)

Material: nucleotídeos de DNA e de RNA

Procedimento

1. Montar a molécula de DNA do roteiro anterior diferenciando a fita molde da fita codificadora.

3. Destacar a substituição de t por u no RNA e comparar as sequências do mRNA e da fita codificadora. Observar que o produto gênico seria diferente se o DNA fosse lido no outro sentido.

4. Separar o mRNA e voltar a unir as duas fitas de DNA.

5. Na folha correspondente colorir ambas as fitas de DNA com uma cor e o mRNA de outra. Insistir no significado do termo transcrever que significa “escrever novamente (um determinado conteúdo) em outro lugar; trasladar, copiar, reproduzir” (Dicionário Houaiss).

ROTEIRO 3. A TRADUÇÃO DA INFORMAÇÃO (mRNA ----> peptídeo)

Material: nucleotídeos de DNA e RNA, aminoácidos.

Procedimento

1. Analisar a estrutura da tabela 1, relacionando os códons aos aminoácidos.

2. Observar que alguns aminoácidos são codificados por numerosos códons e outros por um único códon. Em contrapartida, nenhum códon codifica dois aminoácidos. O código admite sinonímia mas não é ambíguo.

3. Analisar o significado dos códons UAA, UAG e UGA. Estes indicam o fim da sequência, em forma análoga ao ponto em uma frase.

Montar a sequência de mRNA, complementar à fita molde, utilizando os nucleotídeos correspondentes.

4. Determinar na tabela qual a sequência de aminoácidos correspondente a esse mRNA.

ROTEIRO 4. AS MUDANÇAS NA SEQUÊNCIA DO DNA (Mutação gênica)

Material: nucleotídeos de DNA e RNA, aminoácidos.

Procedimento

Montar o DNA, o mRNA e o peptídeo como nos roteiros anteriores.

1. O que acontece quando na posição 17 da fita codificadora do DNA, o nucleotídeo a é substituído por t (mutação)? O ácido glutâmico (gag) será substituído pelo aminoácido valina (gtg) na cadeia de aminoácidos. Esta mutação gera uma hemoglobina anormal (HbS) responsável pela anemia falciforme, uma doença hereditária.

2. O que acontece quando na posição 18 o nucleotídeo g é substituído por a? Esta mutação (de gag a gaa) não modifica o aminoácido incorporado.

3. O que acontece quando na posição 16 o nucleotídeo g é substituído por u? O códon correspondente (uag) não codifica nenhum aminoácido, por conseguinte a cadeia termina no aminoácido prolina.

4. O que acontece quando um nucleotídeo a suplementar é inserido depois do nono nucleotídeo? E se houver uma deleção de t na posição 10? Em ambos os casos o resto da cadeia de aminoácidos será diferente. Quais serão as novas sequências de aminoácidos?

ROTEIRO 5. SEGUINDO O CAMINHO INVERSO (a síntese de DNA no laboratório)

Uma das formas de sintetizar atualmente o DNA no laboratório é mediante máquinas automatizadas, especialmente desenhadas.

Depois de uma revisão do fluxo da informação genética, montar o peptídeo CYIQNCPLG, correspondente ao hormônio ocitocina, também chamado o hormônio do amor. Este hormônio cumpre várias funções relacionadas com o parto, o cuidado da cria e o desenvolvimento de apego e simpatia entre pessoas, além de produzir medo do desconhecido.

1. Qual seria a sequência do mRNA correspondente? Existe mais de uma possibilidade? E se quiséssemos sintetizar o DNA correspondente, qual seria a sequência de nucleotídeos escolhida?

2. Comparar a sequência de aminoácidos da ocitocina com a do hormônio antidiurético vasopressina, que é CTPQNCPRG. Quais seriam as diferenças mínimas nas sequências codificadoras do DNA das mesmas?

Protoplastos podem ser definidos como células sem a parede celular, que pode ser removida tanto por métodos enzimáticos quanto mecânicos. Assim, a célula fica com a sua membrana exposta, sendo esta a única barreira entre o meio intra-celular e o ambiente. Os protoplastos comumente utilizados são os vegetais, embora também existam diversas referências na literatura acerca da obtenção de protoplastos de fungos, especialmente de leveduras.

Os protoplastos apresentam usos em diversas áreas. Podem ser induzidos a fundir, produzindo um híbrido, por exemplo. Híbridos de formação inviável devido à incompatibilidade sexual ou física da espécie podem ser formados por fusão de protoplastos. Seu cultivo in vitro também é amplamente realizado, pois estes têm a capacidade de regenerar plantas inteiras.

Além disso, os protoplastos são capazes de ingerir material extracelular, como DNA, tendo um importante uso na engenharia genética, podendo ser usados para a produção de diversas enzimas e compostos amplamente utilizados na indústria farmacêutica. A técnica da transformação por protoplastos, em que um protoplasto com DNA modificado é inserido em fungos ou bactérias, é utilizada para a produção destas substâncias.

OBJETIVO: obter protoplastos de rúcula (Eruca sativa) mediante digestão enzimática.

MATERIAIS

Folhas frescas de rúcula (Eruca sativa)

Solução de sacarose 1%, Solução de Manitol 13%, Mix de enzimas – Celulase 5% (Celluclast®) e Pectinase 5% (Ultrazyme®)

Pipeta 10 mL, pipeta 1mL, 2 tubos de ensaio, 1 bastão de vidro fino, 2 béquers de 50 mL

Outros: Pipeta Pasteur, pipeta automática 10 µL, ponteira, faca, azulejo, estante para tubos, pinça, 18 microtubos, papel de filtro, lã de vidro, banho-maria a 37 graus Celsius, mini centrífuga, lâmina e lamínula para microscópio óptico.

PROCEDIMENTO

1. Preparo de Soluções

Solução de sacarose 1%: Pesar 0,21g de açúcar em um béquer. Dissolver o conteúdo em 1 mL de água destilada e transferir para um tubo de ensaio.

Solução de Manitol 13%: Pesar 3,25g de Manitol em um béquer. Dissolver o conteúdo em 25 mL de água destilada e transferir para um tubo de ensaio.

Mix de enzimas: Em um tubo de ensaio, pipetar 1,8 mL de água destilada, 0.1 mL de celulase (Celluclast) e 0.1 mL de pectinase (Ultrazyme).

2. Preparo das Folhas

Com a pinça, retirar a epiderme inferior da folha em questão e cortá-la em pedaços pequenos de aproximadamente 5mm x 5mm. Adicionar os pedaços a um tubo com 9,5 mL da solução de Manitol 13% e incubar durante aproximadamente 5 min no Banho-maria.

3. Digestão e Filtração

Com a pipeta de 1mL, pipetar 0,5 mL do mix de enzimas no tubo com o Manitol e os pedaços de rúcula e retorná-lo ao Banho-maria por 20 min, agitando cuidadosamente de tempos em tempos. Filtrar o conteúdo com lã de vidro. Passar o conteúdo para 9 tubos de centrífuga (1 mL em cada um) e encher mais 9 tubos com 1mL de água, de modo a balancear a centrífuga corretamente.

4. Centrifugação

Colocar os microtubos na centrífuga e centrifugar por 5-7 min a 2000 rpm. Quando o rotor parar totalmente, retirar os tubos e desligar a centrífuga. É importante não rotacionar os protoplastos acima de 2500 rpm, levando em consideração sua fragilidade, pois sua membrana celular pode romper-se.

5. Recuperação e análise

Descartar o líquido sobrenadante dos microtubos com uma pipeta Pasteur. Suspender novamente os protoplastos, adicionando 10µL da solução de sacarose 21%. Com a pipeta Pasteur, adicionar 2 gotas do conteúdo à uma lâmina de microscópio devidamente limpa e seca e cobrir com a lamínula. Observar ao microscópio com a objetiva 40x.

NOSSO COMENTÁRIO

Este protocolo é uma adaptação do trabalho de finalização do Curso Técnico de Biotecnologia (Nível Médio) desenvolvido por Karina Lôbo Hajdu em 2014. O protocolo é uma adaptação de Plant Protoplasts (Practical Biotechnology for schools and colleges NCBE- 1993). Os resultados podem ser observados nas figuras abaixo..