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UM POUCO DE HISTÓRIA

Depois de certo tempo, um caldo de carne exposto ao ar apodrece. A observação microscópica mostra muitos tipos de microrganismos. Já que eles não são observados no caldo recém-cozido, podemos nos perguntar: de onde eles vieram?

Até 1850-1860 se admitia a teoria da geração espontânea, isto é que os microrganismos podiam surgir espontaneamente em consequência da alteração dos alimentos.

Baseado em seus estudos sobre as fermentações, Louis Pasteur considera inadequada esta explicação. Para ele, a alteração dos alimentos é uma consequência da presença de microrganismos. Mas, para convencer os seus contemporâneos, Pasteur deverá demonstrar de maneira inequívoca a sua teoria.

QUARTA EXPERIÊNCIA: Os germes estão distribuídos na atmosfera de forma desigual.

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LUGAR DE EXPOSIÇÃO

(Frascos contaminados / Frascos abertos)

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Paris (20/20)

Campo (8/20)

Montanha (1/20)

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UMA REVOLUÇÃO CIENTÍFICA, TECNOLÓGICA E SOCIAL

As evidências experimentais apresentadas por Pasteur levaram seus contemporâneos à substituição da teoria da geração espontânea pela teoria dos germes.

Admite-se que os germes presentes no meio ambiente são responsáveis pelas alterações dos meios orgânicos (fermentações, putrefação, doenças).

A teoria dos germes abriu novos caminhos na utilização industrial dos processos fermentativos, na conservação dos alimentos e na luta contra as doenças infecciosas.

NOSSO COMENTÁRIO

Com poucos elementos é possível montar um experimento que permita ampliar a segunda experiência e acompanhar o raciocínio de Pasteur

BIBLIOGRAFIA

BIBLIOGRAFÍA

ORIEUX M. & EVERAERE M.Sciences Naturelles: Anatomie et Physiologie Humaines. Paris, Hachette.

O livro não leva data de edição; estimo que tenha sido publicado nos primeiros anos dadécada de 1970.

02. O LAVADO DAS MÃOS

Em 1850, o médico húngaro Ignaz F. Semmelweis mostrou que o número de mortes de mulheres atingidas por febre puerperal diminuía quando o obstetra lavava as mãos depois de uma autopsia e antes de examinar as parturientes.

As ideias de Semmelweiss encontraram sustentação na segunda metade do século XIX, com o enunciado da teoria dos germes (Louis Pasteur) e a descoberta do fenol como agente antisséptico (Joseph Lister).

As medidas higiénicas reduziram o número de mortes por infecções pós-operatórias, dando início a uma nova era no campo da cirurgia.

A pesar de contar hoje com numerosos agentes antimicrobianos, o alto número de infecções hospitalares e a aparição de bactérias resistentes aos antibióticos nos mostram que as medidas de precaução continuam sendo essenciais.

Mais de 150 anos depois de Semmelweiss, o lavado das mãos é a medida fundamental para prevenir a transmissão de germes. Os passos a seguir para un correto lavado de manos figuram em numerosas publicações da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em tempos de COVID-19 convém ter em conta as recomendações por uma desinfecção com alcool-gel .

OBJETIVO: Mostrar a importância do lavado das mãos.

MATERIAIS

Por aluno: 1 placa de Petri contendo ágar nutriente, 2 cotonetes esterilizados.

Por grupo: pia com água e sabão, 1 recipiente para descartar os cotonetes, 1 pilot.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard.

Os alunos trabalharão em duplas, um deles será o pesquisador (A) e o outro o sujeito estudado (B).

PRIMEIRA PARTE

Anotar na parte superior da placa de Petri o nome do aluno. Na parte inferior, delimitar com o pilot duas regiões: antes e depois.

2. O aluno A raspará com um cotonete a mão dominante de B: dedos, palma, dorso e regiões interdigitais.

Com muito cuidado A abrirá a placa de Petri e deslizará o cotonete na região antes, como mostrado no esquema.

4. B lavará as mãos com água morna e sabão esfregando o dorso, as palmas, os dedos e os espaços interdigitais durante 10-15 segundos. A seguir e sem tocar nada, B as deixará secar no ar. Neste ponto, a paciência é fundamental.

O aluno A repetirá o procedimento descrito nos itens 2 e 3, desta vez na região depois da placa.

SEGUNDA PARTE

Repetir o procedimento de 1 a 5 invertendo os roles de A e B.

Fechar as placas com fita adesiva.

Incubar as placas em posição invertida, a temperatura ambiente (25 a 28 graus Celsius), durante 48 horas.

TERCEIRA PARTE

Observar o crescimento microbiano nas duas regiões das placas e registrar os resultados como (0) = nenhum crescimento; (+) pouco crescimento; (++) muito crescimento.

Comparar esses resultados com os que foram obtidos pelas outras duplas. Se for possível, estimar a eficiência do tratamento mediante a relação: 100 x (Número de colônias antes do tratamento - Número de colônias depois do tratamento) / Número de colônias antes do tratamento).

NOSSO COMENTÁRIO

Existem numerosas variáveis desta atividade, que é muito popular entre os alunos. Esta atividade é é uma adaptação da prática encontrada em Home Science Tools

Do ponto de vista prático, o secado prévio das placas é indispensável para a observação de colônias isoladas (COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

Do ponto de vista de segurança, algumas precauções são necessárias, porque no meio nutriente crescerão microrganismos desconhecidos. As placas deverão ser fechadas com fita adesiva e permanecer fechadas durante toda a avaliação dos resultados. Uma vez finalizada a atividade as placas serão esterilizadas antes de se proceder ao descarte do material.

A figura abaixo mostra resultados obtidos no laboratório de ensino, mostrando a necessidade do/a professor/a destacar a importância de lavar as mãos depois de ir ao banheiro e antes de comer.

COMO MONTAR UM PROJETO

Comparar a eficiência de diferentes sabões.

Investigar a eficiência de diferentes antissépticos (álcool, álcool-gel, água oxigenada etc.).

Diferenciar um desinfetante de um antisséptico.

Pesquisar o modo de ação dos agentes antissépticos e sua utilização na vida cotidiana.

A partir de 1867, a utilização sistemática de fenol por Lister conseguiu reduzir, a mortalidade por amputação de 65 a 15%. Quais os antissépticos que substituíram o fenol?

03. OS MICRORGANISMOS DO AMBIENTE

"Provavelmente, as primeiras formas de microrganismos habitavam a água. Com o passar do tempo, o solo se tornou infectado e, agora, aí se encontra a maior parte deles. Do solo passam ao ar pelo vento, que levanta partículas de poeira nas quais os microrganismos estão presentes. Desde que vivemos em contato com o ar, aspiramos enormes quantidades de microrganismos cada vez que respiramos. O ar deposita-os em nosso cabelo, roupa e pele. Do ar passam para nosso alimento e bebida. Estamos completamente cercados por microrganismos e precisamos aprender a viver com eles. Felizmente, a maior parte não causa mal. Relativamente são poucos que causam prejuízos. É contra os que causam doenças ou estragam nossos alimentos que devemos nos prevenir" (Neder R.N. Microbiologia, São Paulo, Ed. Nobel, 1992).

OBJETIVO

Estudar a distribuição dos microrganismos em diferentes ambientes.

MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri contendo meio nutriente estéril, 1 caneta de retroprojetor.

PROCEDIMENTO

1. Escolher um lugar para colocar a placa de Petri.

2. Rotular a placa com a caneta de retroprojetor, indicando o lugar onde esta será exposta. No lugar escolhido, destampar a placa como indicado no esquema, aguardar 15 minutos e fechá-la novamente.

3. Compare os seus resultados com os dos outros grupos.

Onde foi exposta a placa que apresentou um número maior de colônias? Onde foi exposta a placa que apresentou menor número de colônias? Em função dos resultados obtidos, qual a distribuição dos microrganismos no ambiente estudado?

NOSSO COMENTÁRIO

Trata-se de uma atividade simples que permite discutir la distribuição dos microrganismos no ambiente. Seja quando se estude um prédio, seja quando se pesquise a contaminação de objetos de uso cotidiano.

Na história da humanidade, as especiarias foram a causa de explorações e conquistas. Marco Polo, Cristóbal Colón, Magalhães e tantos outros navegantes recorreram o mundo procurando a rota das especiarias: canela, cravo, gengibre, pimenta etc...

Até o século XIX, o secado, a salga e a defumação eram os principais métodos de conservação das carnes. Além de melhorar o sabor, as especiarias contribuíram com suas propriedades germicidas a prolongar a duração dos alimentos.

Por outro lado, as especiarias têm sabidamente algumas propriedades terapêuticas: os extratos de pimenta calmam dores e o gengibre as náuseas e a inflamação, o óleo de cravo é um anestésico e a cúrcuma um antioxidante.

OBJETIVO: Testar a inibição do crescimento bacteriano por diversas substâncias do dia-a-dia.

MATERIAIS

Por grupo: uma placa de Petri estéril contendo ágar nutriente, 1 swab ou cotonete esterilizado, 1 cultura de Escherichia coli, discos de papel de filtro estéreis, 1 pinça.

Por turma: Produtos naturais dissolvidos ou esmagados em água destilada (extratos como o óleo de eucalipto, folhas como a hortelã, bulbos como o alho, especiarias como a mostarda, a canela, o cravo, a pimenta etc.).

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

1. Rotular a placa de Petri.

2. Abrir o tubo e embeber o swab com o cultivo bacteriano; fechar o tubo.

3. Abrir a placa e esfregar cuidadosamente o swab na superfície da placa, para formar um tapete bacteriano. Fechar a placa e aguardar até que o líquido tenha sido absorvido.

4. Abrir a placa e, com a pinça, colocar na superfície do meio um papel embebido em água destilada (controle).

5. Repetir o item anterior com 3 papéis embebidos no produto a testar.

6. Fechar a placa.

7. Incubar a placa boca abaixo, a 37 graus Celsius durante 2 dias.

8. Observar a inibição do crescimento bacteriano em função da presença de um halo em redor do disco ou sua ausência.

NOSSO COMENTÁRIO

Esta atividade costuma empolgar os alunos. As fotos mostram os resultados de uma turma do Nono Ano (Ensino Fundamental 2), sem treinamento prévio em técnicas microbiológicas (Figura). Os tapetes não estão perfeitos, mas é possível visualizar claramente a ação inibidora de vários produtos no crescimento bacteriano. Obviamente, não é possível comparar a intensidade da ação inibitória de dois produtos diferentes.

Figura: Inibição do crescimento bacteriano por extratos de diversas plantas (Alho, pimenta, canela e wasabi, um produto derivado da raíz-forte)

COMO MONTAR UM PROJETO

- Testar a inibição do crescimento bacteriano por diversas especiarias (cravo, canela, pimenta, orégão, alecrim etc.), orientando o trabalho para a conservação de alimentos.

- Testar a inibição do crescimento bacteriano por extratos de plantas utilizados como desinfetantes (eucalipto, pinho etc.), orientando a pesquisa para a higiene ambiental.

- Testar a inibição do crescimento bacteriano de diferentes concentrações de uma substância com efeito inibitório conhecido.

-Testar a inibição do crescimento de diferentes microrganismos por uma substância com efeito inibitório conhecido.

Vários tipos de microrganismos se desenvolvem na pele, especialmente nas dobras e partes mais úmidas associadas às glândulas sudoríparas. Sua atividade metabólica causa o cheiro da transpiração.

Na composição química dos desodorantes entram substâncias que promovem a oxidação de ácidos graxos e aminas, como o peróxido de zinco. Também podem ser acrescentadas substâncias antibacterianas que inibem o crescimento dos microrganismos responsáveis pelo cheiro da transpiração.

Existem diversas formulações no mercado, com e sem fragrância, com ou sem álcool, com ou sem agentes antibacterianos, acondicionados de diferentes modos (creme, roll-on, spray).

OBJETIVO Estudar a ação inibitória de vários desodorantes corporais no crescimento de Micrococcus luteus.

MATERIAIS

Uma placa contendo meio nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta ou conta-gotas estéril, 1 swab ou cotonete estéril, 4 desodorantes corporais (A, B, C e D), 5 discos de papel de filtro esterilizados (COMPLEMENTOS TÉCNICOS), 1 pinça, pilot, bico de Bunsen.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (A, B, C e D).

Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus no ágar nutriente da placa de Petri. Distribuir com o swab.

Em condições assépticas, colocar com a pinça um disco de papel de filtro estéril no centro da placa (controle).

Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o desodorante A. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.

Repetir o procedimento com os desodorantes B, C e D.

Rotular a placa e incubar a 30°C durante 48 a 72 horas.

Observar a presença (+) ou ausência (-) de um halo em redor dos discos embebidos com desodorante.

8. Comparar os resultados obtidos com cada desodorante, sabendo que a inibição do crescimento em redor do disco indica a presença de algum agente químico, inibidor do crescimento microbiano.

NOSSO COMENTÁRIO

Do ponto de vista técnico é possível obter placas melhores substituindo o swab por a alça de Drigalsky, que permite espalhar melhor o tapete bacteriano. O problema com essas alças é que as de vidro quebram facilmente e as de plástico não podem ser esterilizadas, só desinfetadas.

A escolha de Micrococcus luteus para esta atividade está justificada por tratar-se de uma bactéria da flora normal da pele, que pode ser utilizada no ensino. A figura mostra um exemplo dos resultados que podem ser obtidos no laboratório de ensino.

Encontramos ação inibitória nos quatro desodorantes testados. Obviamente, o procedimento seguido não permite comparar a intensidade da ação inibitória dos diferentes produtos, de modo que os resultados são qualitativos.

Testes complementares com outros microrganismos (Escherichia coli e Bacillus subtilis) tiveram também resultados positivos.

Figura: Inhibição do crescimento de 3 microrganismos (Micrococcus luteus, Escherichia coli e Bacillus subtilis) por 4 desodorantes do mercado.

Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na cavidade oral. Muitos são inofensivos, outros não. Algumas bactérias fermentam os carboidratos (predominantemente a sacarose) produzindo ácido que dissolve os sais de cálcio, num processo de desmineralização. A destruição localizada do tecido dental forma a cárie dentária.

O escovado dos dentes e o uso do fio dental são as duas ações mais eficientes na remoção do biofilme bacteriano, causa da carie e da gengivite. Os dentifrícios são produtos cosméticos utilizados na limpeza da cavidade bucal.

OBJETIVO: estudar a ação inibitória de diferentes dentifrícios sobre o crescimento de Micrococcus luteus.

MATERIAIS

Uma placa de Pétri contendo agar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta ou conta-gotas estéril, 1 swab ou cotonete estéril, 4 tipos de dentifrícios, 5 discos de filtro esterilizados, 1 pinça, pilot, bico de Bunsen.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (1, 2, 3 e 4).

Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus na superfície do meio nutriente. Distribuir com o swab.

Em condições assépticas, colocar com a pinça um disco de papel de filtro estéril no centro da placa (controle).

Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o dentifrício 1. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.

Repetir o procedimento com os dentifrícios 2, 3 e 4.

Rotular a placa e incubar a 30 graus Celsius durante 48 a 72 horas.

Observar a presença (+) ou ausência (-) de um halo em redor do disco embebido com dentifrício.

8. Comparar os resultados obtidos com cada dentifrício, sabendo que a inibição do crescimento em redor do disco indica a presença de algum agente químico, inibidor do crescimento microbiano.

NOSSO COMENTÁRIO

Do ponto de vista técnico é possível obter placas melhores substituindo o swab por a alça de Drigalsky, que permite espalhar melhor o tapete bacteriano. O problema com essas alças é que as de vidro quebram facilmente e as de plástico não podem ser esterilizadas, só desinfetadas.

A escolha de Micrococcus luteus para esta atividade está justificada por tratar-se de uma bactéria da flora normal da pele, que pode ser utilizada no ensino.

A figura mostra um exemplo dos resultados que podem ser obtidos no laboratório de ensino. Encontramos ação inibitória nos quatro dentifrícios testados. Obviamente, o procedimento seguido não permite comparar a intensidade da ação inibitória dos diferentes produtos, de modo que os resltados são qualitativos.

A sobrevivência de um microrganismo exposto à luz ultravioleta varia em função da espécie e da dose aplicada. Lâmpadas especiais que emitem luz UV com comprimento de onda entre 270 e 230 nm são utilizadas para reduzir o número de microrganismos no ar, em superfícies de salas cirúrgicas e em salas assépticas onde produtos esterilizados são distribuídos em garrafas ou ampolas estéreis.A sobrevivência de um microrganismo exposto à luz ultravioleta varia em função da espécie e da dose aplicada.

A exposição excessiva do homem à luz ultravioleta pode causar queimaduras na pele e um quadro de conjuntivite com formação de catarata nos olhos. Por estas razões deve se ter muito cuidado no manuseio de uma fonte de luz ultravioleta. Seja colocando a fonte de luz dentro de uma caixa preta, seja utilizando a luz UV no fluxo laminar, todos os cuidados são indispensáveis.

O vidro normal é parcialmente transparente aos raios ultravioletas, deixando passar 90% da luz acima dos 350 nm. Por isso, óculos apropriados e painéis de vidro entre a fonte e o operador permitem mitigar os riscos. De todos os modos, a manipulação deve estar a cargo do/a Professor/a, como profissional ciente dos riscos envolvidos.

OBJETIVO: Estudar a ação germicida da luz ultravioleta

A luz ultravioleta é perigosa. A fonte só pode ser operada pelo/a Professor/a. O operador deve estar protegido por barreiras (parede de vidro, óculos de segurança etc.), principalmente em relação aos olhos e a face. Em caso de exposição excessiva, podem ocorrer queimaduras e, em algumas condições, um quadro de conjuntivite.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

Rotular uma placa como C (controle) e numerar as restantes de 1 a 6.

Com um cotonete, em condições assépticas, inocular a superfície do ágar de todas as placas, espalhando um tapete de microrganismos.

Colocar as placas 1 a 6 em posição de receber a luz ultravioleta.

Substituir a tampa de vidro das placas 1 a 5 pelos cartões vazados, como indicado no esquema ao lado. Na placa 6, colocar o cartão vazado sobre a tampa de vidro.

Expor as placas à luz UV durante 30 seg. (placa 1), 1 min. (placa 2), 5 min. (placa 3), 10 min. (placa 4) e 20 min. (placas 5 e 6).

Incubar as sete placas à temperatura ambiente por 24 a 48 hs.

7. Observar o crescimento dos microrganismos na região da placa correspondente à área vazada dos cartões.

8. Registrar as observações como (++): crescimento normal; (+): crescimento intermediário; (0): ausência de crescimento

NOSSO COMENTÁRIO

Esta atividade sempre desperta o interesse dos alunos. Utilizamos como fonte de luz ultravioleta a lâmpada do fluxo laminar, como mostra a figura ao lado.

Temos desenvolvido esta atividade com Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae e Rhodotorula, que são os microrganismos com os que trabalhamos habitualmente.

A figura mostra os resultados obtidos com Rhodotorula. A medida que o tempo de exposição aumenta, fica mais clara a ausência de crescimento na parte do meio que recebeu a irradiação.

OBJETIVO: Evidenciar a ação germicida de uma solução antifúngica de uso tópico e venda livre nas farmácias.

MATERIAIS

Uma placa contendo ágar nutriente estéril (Sabouraud), 1 cultura em caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1 pipeta estéril, 1 swab ou palinete esterilizado, uma solução antifúngica, 5 discos de papel de filtro esterilizados, 1 pinça estéril, pilot.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard

1. Rotular a placa e dividir a parte inferior em 4 setores.

2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Saccharomyces cerevisiae no ágar nutriente e distribui-las com um swab.

3. Em condições assépticas, colocar com a pinça um disco de papel de filtro estéril (controle) no centro da placa.

4. Mantendo a assepsia, colocar com a pinça um disco de papel de filtro embebido no produto em cada um dos quatro setores.

5. Incubar a placa a temperatura ambiente (30 graus Celsius, aproximadamente) durante 48 a 72 horas.

6. Observar o crescimento das leveduras e a aparição de halos de inibição.

7. Interpretar os dados obtidos.

NOSSO COMENTÁRIO

O experimento mostra a ação germicida de produtos antifúngicos sobre a levedura Saccharomyces cerevisiae. No centro da placa, o disco de papel de filtro estéril é o controle do experimento. Na parte externa várias repetições com discos de papel de filtro embebidos no mesmo produto antifúngico permitem confirmar os resultados.

Foram testadas quatro soluções (A, B e C) e uma solução de álcool 70% como controle complementar para o produto A. O desenho experimental não permite comparar a eficiência das soluções, de modo que os resultados são qualitativos (positivos ou negativos). Salvo o álcool 70%, todos os produtos comerciais mostraram ação germicida em relação a Saccharomyces cerevisiae (Figura 1).

Um desinfetante é uma substância química que mata as formas vegetativas de microrganismos patogênicos, mas não necessariamente suas formas esporuladas. Um germicida difere de um desinfetante em que mata microrganismos que não são necessariamente patogênicos. O desinfetante/germicida de uso doméstico mais conhecido é o hipoclorito de sódio (NaOCl), comercialmente conhecido como água sanitária.

Em contato com a água, os hipocloritos formam ácido hipocloroso que sofre uma nova reação, originando oxigênio nascente, um poderoso agente antioxidante que pode destruir substâncias vitais.

Cl2 + H2O → HCl + HClO

Ácido clorhídrico Ácido hipocloroso

HClO → HCl + O

Oxigênio nascente

FONTE: PELCAR M.J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicações. Volume 1. Segunda Edição. São Paulo, Makron Books, 1996.

OBJETIVO: Pesquisar a ação germicida de diversas concentrações de um desinfetante.

MATERIAIS

Uma placa de Petri contendo ágar nutriente estéril, 4 tubos com 2 mL de água esterilizada, 4 pipetas de 1 mL, 1 pipeta Pasteur estéril, 1 swab, 1 tubo com 4 mL de desinfetante, 1 pinça estéril, bico de Bunsen, um tubo com o cultivo bacteriano indicador (Escherichia coli, Bacillus subtilis ou Micrococcus luteus), pilot.

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard (COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

A. Preparação do tapete bacteriano

Com a pipeta Pasteur, colocar umas gotas do cultivo bacteriano na superfície do ágar nutriente. Espalhar com o swab de modo a obter um tapete (COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

B. Preparação das diluições do desinfetante

Transferir 2 ml da suspensão bacteriana de um tubo ao seguinte, iniciando o procedimento a partir do tubo com o desinfetante concentrado. Utilizar uma pipeta diferente de modo a evitar o arraste de material de um tubo a outro.

Um esquema geral dos passos a seguir se encontra representado na Figura 1. Entre uma diluição e a outra, misturar bem o conteúdo dos tubos, mexendo-os por rotação, como indicado no esquema abaixo

C. O TESTE

1. Rotular a placa dividindo-a em 6 setores.

2. Colocar um disco estéril seco como controle negativo (C-).

3. Pegar outro disco estéril com a pinça e embebê-lo com a solução mais diluída do desinfetante (6,25%). Abrir a placa e colocar o disco no lugar correspondente. Fechar a placa.

4. Repetir o item anterior com cada uma das soluções restantes (12,5%, 25%. 50%).

5. Repetir o mesmo item com o desinfetante concentrado (Controle positivo, C+).

6. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 48-72 horas.

7. Observar os resultados. A presença de um halo em redor do disco de papel revela a ação germicida do desinfetante.

NOSSO COMENTÁRIO

Esta atividade requer bastante material e sua execução apresenta algumas dificuldades. Contudo, os resultados são extremamente interessantes.

A figura mostra os resultados obtidos com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio (água sanitária comprada em um supermercado do bairro). Utilizamos a mesma série de diluições com dois bioindicadores diferentes: Escherichia coli e Bacillus subtilis.

No caso de Escherichia coli, observa-se a ação germicida da água sanitária em diluições de até 12,5%. Já no caso de Bacillus subtilis, a ação germicida é bem menos evidente, revelando a existência de numerosas colônias resistentes mesmo em altas concentrações.

10. AS NORMAS DE TRABALHO STANDARD

1. Acesso ao laboratório com vestimenta adequada. Tirar as joias (brincos, colares), e também os chapéus e bonés. Não usar roupas largas demais, nem sapatos abertos (sandálias). Prender o cabelo. Vestir um jaleco de algodão.

2. Acesso ao laboratório limitado ou restrito quando os experimentos estão em andamento (Decisão do Professor).

3. Ter certeza de ter entendido bem os procedimentos antes de começar.

4. Lavar as mãos antes e depois de realizar o procedimento.

5. Não fumar, beber, comer, chupar balas, morder o lápis, aplicar lentes de contato nem cosméticos.

6. Manter a bancada bem organizada.

7. Utilizar as técnicas assépticas apropriadas para trabalhar com cultivos bacterianos, microbianos ou virais.

8. Não pipetar com a boca, minimizar a formação de aerossóis.

9. Limpar a bancada pelo menos 1 vez ao dia e a cada vez que se produz um derramamento com um desinfetante apropriado.

10. Limpar e descartar adequadamente o material utilizado.

A contagem em placas é um dos métodos mais utilizados para determinar qual o número de microrganismos viáveis em um meio líquido. Quando a concentração é baixa, a amostra é filtrada através de um membrana que será colocada em uma placa de Petri com meio nutriente. Os microrganismos retidos na membrana se desenvolverão formando colônias, possibilitando a quantificação.

Quando a concentração é alta, procede-se à preparação de diluições seriadas em uma sequência de 1:10, chegando a diluições de 10-7 ou mais. Pequenas alíquotas dessas diluições são semeadas no meio nutriente das placas, onde as bactérias se desenvolverão formando colônias.

Nas placas em que a concentração da alíquota semeada for muito alta, as bactérias formarão um tapete e se a concentração for muito baixa, o número de colônias pode também ser muito baixo. Entre os dois extremos, alguma das placas apresentará um número de colônias compreendido entre 20 e 300, um número que permite a quantificação.

Como esta técnica demanda muito material, consideramos que uma simplificação como a de Wymer pode ser muito útil no laboratório de ensino.

OBJETIVO: Determinar o número de microrganismos de uma cultura bacteriana.

MATERIAIS

Cultura de Escherichia coli, preparada no dia anterior e diluída a 10-4 pouco antes da aula, 1 placa de Petri contendo meio nutriente, 5 tubos de ensaio com 4,5 mL de solução salina estéril, 1 pipeta de 1 mL, 1 pipeta Pasteur, recipiente de descarte com desinfetante, fita adesiva, pilot, estufa a 37 graus Celsius.

Antes de começar, verificar a ausência de água de condensação na placa de Petri. Em caso contrário proceder ao secado das placas (COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

Todo o procedimento deve ser desenvolvido em condições assépticas.

C. SEMEADURA

1. Retirar com a pipeta Pasteur uma pequena quantidade de líquido do tubo F, de concentração 10-9 (diluição 109).

2. Abrir a placa de Petri e deixar cair uma gota no setor rotulado -9.

3. Fechar a placa e devolver o excesso de líquido ao tubo F.

4. Repetir os passos anteriores com os tubos E, D, C, B e A.

5. Descartar a pipeta, no recipiente com desinfetante.

6. Fechar a placa e incubar a temperatura adequada durante 24-48 horas.

7. Observar a placa e procurar um setor onde possam ser diferenciadas entre 10 e 20 colônias.

8. Calcular quantas vezes a cultura A foi diluída nessa gota.

9. Calcular a concentração de microrganismos no tubo A, com base no número de colônias e na diluição correspondente.

Dica: Estima-se que uma pipeta calibrada 1 mL de líquido contém 20 gotas.A diluição do cultivo original foi realizada com uma única pipeta, partindo do tubo mais concentrado em direção ao tubo menos concentrado. Na semeadura, invertemos esse sentido. Quais os erros introduzidos por esses procedimentos?

NOSSO COMENTÁRIO

As atividades práticas de titulação demandam uma quantidade muito grande de material, o que muitas vezes as torna inviáveis no laboratório de ensino. Este protocolo, extraído do livro de Wymer “Practical Microbiology and Biotechnology for Schools”, resulta muito interessante, porque permite introduzir o procedimento de um modo mais simples. Contudo, exige alguma experiência prévia e bastante habilidade manual. Os resultados podem ser vistos na Figura.

Muitas das atividades apresentadas nestes guias exigem que o ágar nutriente esté seco.

Em caso contrário, em vez de formar colônias isoladas as bactérias crescerão formando uma mancha. É um detalhe que pode estragar todo o seu trabalho.

Existem várias formas de conseguir placas secas:

1. Aguardar antes de colocar o meio nutriente na placa. Quando o meio está muito quente forma-se água de condensação, mas cuidado! Se o meio esfriar se formarão grumos. A temperatura ideal é de 50 graus Celsius.

13. A TÉCNICA DO TAPETE MICROBIANO

A técnica do tapete bacteriano permite obter uma camada homogênea de crescimento bacteriano, por semeadura de uma suspensão bacteriana em uma placa de Petri contendo o meio nutriente sólido adequado. A técnica se aplica também a algas e leveduras. Geralmente é utilizada para evidenciar a ação germicida de alguma substância.

MATERIAL: placa de Petri contendo ágar-nutriente estéril, alça de níquel-cromo ou swab, suspensão bacteriana.

PROCEDIMENTO

Em condições assépticas e sem perfurar o ágar, colocar na superfície do meio uma alça ou uma gota da suspensão. Este material é o inóculo inicial.

Espalhar o inóculo inicial em linhas muito juntas, de modo a cobrir toda a superfície do meio. Será necessário virar a placa várias vezes para alcançar toda a superfície sem perfurar o ágar nutriente.

14. A TÉCNICA DE ESGOTAMENTO DO INÓCULO

A técnica de esgotamento do inóculo permite obter colônias isoladas, a partir de uma suspensão bacteriana semeada em uma placa de Petri contendo o meio nutriente sólido adequado.

MATERIAL: bico de Bunsen, placa de Petri contendo ágar-nutriente estéril, alça de níquel-cromo, suspensão de Escherichia coli.

PROCEDIMENTO

Ligar o bico de Bunsen.

Marcar na base ou nas laterais da placa os pontos A, B, C e D.

Em condições assépticas e sem perfurar o ágar, colocar na superfície do meio (ponto A) uma alça da suspensão. Este material é o inóculo inicial.

Flambar a alça e espalhar o inóculo inicial em linhas na área correspondente a A.

Flambar a alça e virar a placa para semear na área correspondente a B, em ângulos retos às linhas paralelas já feitas.

Flambar a alça e virar a placa para semear na área correspondente a C, em ângulos retos às linhas paralelas já feitas.

Desligar o bico de Bunsen.

Incubar as placas a 37 graus Celsius, com a tampa voltada para baixo.

As colônias isoladas devem aparecer no final da semeadura (região CD).

Figura: o procedimento e o resultado obtido

NOSSO COMENTÁRIO

Trata-se de um procedimento de rotina para o isolamento de bactérias em culturas puras. Se este for o objetivo, convém preparar a suspensão com uma mistura de duas espécies que possam ser diferenciadas pela cor das colônias como, por exemplo Escherichia coli (colônias brancas) e Micrococcus luteus (colônias amarelas).

Antes de iniciar o procedimento verificar que a placa de Petri esté bem seca, porque a umidade condensada sobre o meio arrasta as bactérias sobre a superfície da placa, formandose uma mancha em vez de colônias isoladas (COMPLEMENTOS TÉCNICOS).

15. PREPARAÇÃO DOS DISCOS DE PAPEL

Você pode preparar seus discos com uma máquina para furar papel.

A esterilização pode ser realizada de vários modos:

Imersão em etanol 96 0 durante uma noite. Deixar evaporar o etanol até os discos secarem.

Esterilização dos discos embrulhados em papel alumínio, com calor seco (no forno, a 300 graus Celsius durante 30 minutos) ou com calor úmido (autoclave ou panela de pressão, a 121 graus Celsius durante 20 minutos).

NOSSO COMENTÁRIO

Este protocolo foi desenvolvido em 2011 por Luciana Bokehi e Vítor Veloso Absalão, como trabalho de finalização do Curso Técnico (Nível Médio) de Biotecnologia no Instituto de Tecnologia ORT do Rio de Janeiro.

Aplicações : matéria de Química Biológica no mesmo Instituto; treinamento prático dos ganhadores da Olimpíada Brasileira de Biologia, prévio às competições Ibero-americanas e Internacionais de 2011 e 2012.

BIBLIOGRAFIA

MARTINEZ, E.R.M. e PAIVA, L.R.S. ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS: UMA PRÁTICA PARA O ENSINO DE GENÉTICA. Acessado em 01.10.2011

UNIVERSITY OF OXFORD. Kitchen electrophoresis. Acessado em 01.10.2011

Colorful Electrophoresis. Acessado em 09.10.2011

Two Simple and Inexpensive Laboratory Exercises for Teaching Agarose Gel Electrophoresis. Acessado em 09.10.2011

Electroforesis Casera. Acessado em 09.10.2011