educbiotecnologia - Micropropagação

Dracaena sanderiana é um arbusto perene, classificado na família das Ruscaceae, que pode alcançar uma altura de 1,5m. De origem africana, se adapta bem aos climas quentes e úmidos. Com o nome de bambu-da sorte, Dracaena é considerada uma planta de interior pouco exigente que se multiplica facilmente por estacas e cresce bem a uma temperatura entre 20 e 30 graus Celsius, com iluminação indireta.

O CULTIVO NA ÁGUA

Mudar a água semanalmente. Evitar a água da torneira, rica em cloretos e fluoretos aos quais a planta é sensível, e substituir por água mineral. Como escolhas alternativas, considerar a água de chuva e a água destilada. Se tiver que usar água da torneira, deixar que repouse 24 horas antes de fazer a troca. A cada dois ou três meses, adicionar 2 gotas de fertilizante de plantas para aquários. Colocar pedrinhas no fundo para sustentar a haste. Manter fechada com algodão a boca dos frascos, para evitar a proliferação de mosquitos.

Se tiver que usar água da torneira, deixar que repouse 24 horas antes de fazer a troca. A cada dois ou três meses, adicionar 2 gotas de fertilizante de plantas para aquários. Colocar pedrinhas no fundo para sustentar a haste. Manter fechada com algodão a boca dos frascos, para evitar a proliferação de mosquitos

OBJETIVO

Propagar, por estaquia, uma rama de Dracaena sanderiana.

MATERIAL

Uma rama grande de Dracaena sanderiana, 1 faca, recipientes adequados, pedrinhas de aquário ou equivalentes, água minera, parafina derretida.

PROCEDIMENTO

1. Retirar as folhas da rama de Dracaena, deixando só algumas folhas no extremo superior.

2. Cortar a rama de Dracaena de modo a obter estacas de aproximadamente 15 a 20 cm. O corte deve ser feito na metade de um entrenó e cada estaca deve incluir pelo menos um nó. Manter a posição original das estacas.

3. Molhar o corte superior das estacas na parafina. O selado evitará a contaminação bacteriana mas, obviamente, o tratamento não se aplica à estaca da extremidade superior da rama.

4. Colocar as estacas em um recipiente, mantendo-as em posição vertical com as pedrinhas de aquário.

5. Adicionar água mineral verificando que a camada de água chegue a 1cm ou 2cm acima das pedrinhas e cubra aproximadamente 1/3 da estaca.

6. Trocar a água semanalmente e, quando se formem raízes, transplantar a terra.

NOSSO COMENTÁRIO

O bambu-da-sorte se propaga com muita facilidade. As figuras abaixo mostram o brotamento de estacas com um único nó, colocadas horizontalmente no solo. Para enraizar diretamente as estacas no solo, aconselha-se que sejam plantadas verticalmente, deixando sempre um nó dentro da terra.

02. OBTENÇÃO DE CLONES DE VIOLETA AFRICANA A PARTIR DA FOLHA

O gênero Saintpaulia conta com 6 espécies, denominadas habitualmente violetas africanas em homenagem ao barão Walter von Saint Paul St Claire, quem as descobriu a finais do século XIX nas montanhas de Usambara, Província do Cabo, Sul África.

As violetas africanas são plantas relativamente fáceis de cultivar. As folhas não devem ser molhadas e a rega costuma ser feita desde baixo, duas vezes por semana. A forma mais simples de multiplicação é por enraizamento das folhas.

A edição especial da Revista dos Amantes da Natureza VIOLETAS indica que o método mais fácil de propagar (=clonar) violetas é o de enraizar folhas na água. “Com este objetivo, selecione folhas de tamanho médio e remova-as da planta-mãe deixando pecíolos (cabinhos) de 3 a 5 centímetros. No pecíolo de cada folha faça um corte transversal com uma lâmina bem afiada. Encha um copo com água e prenda um pedaço de papel alumínio na boca do copo. Faça uma fenda no alumínio e insira a folha, de modo que uma parte do pecíolo fique mergulhada na água. Coloque o copo em uma janela bem iluminada, porém não ensolarada. Em circunstâncias normais, a partir daí, as raízes se formarão entre duas e quatro semanas. Quando as novas folhas, devidamente enraizadas, tiverem aproximadamente 3 cm de comprimento, você já pode transplantar a mudinha para um vaso contendo solo. “

Também podem ser colocadas na terra, depois de colocar no pecíolo um pouco de hormônio de enraizamento, adquirido no comercio. Para que as mudas se desenvolvam bem, diversos fatores devem ser levados em conta: temperatura, irrigação, umidade ambiente, iluminação, composição do solo, adubação. As condições ideais são detalhadas a seguir:

TEMPERATURA: 22 a 24 graus Celsius.

IRRIGAÇÃO: À temperatura ambiente, evitando a água clorada ou alcalina. O solo nunca deve ficar encharcado. Não é recomendável molhar as folhas. Vasos de 12 a 15 cm de diâmetro devem ser regados 3 vezes por semana, e vasos menores com maior frequência. O método mais prático é regar por baixo, por capilaridade a condição de, uma vez por mês, fazer a rega por cima e drenar os sais acumulados.

UMIDADE: 40 a 60 % Pode ser obtida colocando as violetas sobre uma bandeja com cascalho e água.

ILUMINAÇÃO: Procurar um meio termo. No caso de usar luz artificial prever 2 lâmpadas fluorescentes de 40 watts ligadas 12 horas por dia, a uma distância mínima de 15 a 20 cm, para um grupo de 9 a 12 vasos.

SOLO: Uma mistura adequada está formada por uma parte de terra comum de jardim, 1 parte de composto orgânico e 1 parte de areia de construção. Depois de peneirada, a mistura será esterilizada.

ADUBAÇÃO: Inorgânica: NPK 10-10-5 OU 20-20-10. Orgânica: farinha de osso, farinha de peixe, esterco, composto orgânico, torta de soja, torta de algodão ou torta de mamona. Frequência: 1 vez por mês

Quantas plantas-filhas obtivemos a partir da planta-mãe? Quanto tempo demorou o processo de enraizamento? Quais os cuidados dados às mudas?

NOSSO COMENTÁRIO

Além de ser a forma mais simples de iniciar a clonagem da violeta africana, a propagação na água permite observar o crescimento de raízes e a aparição de folhinhas. A figura mostra a importância de efetuar um pequeno corte no pecíolo nas folhas colocadas para enraizar na água. O uso de uma faca pode ser evitado raspando com a unha o pecíolo, a 1 cm da base da lâmina foliar.

Os dois maiores inconvenientes do enraizamento na água são o apodrecimento dos pecíolos e a necessidade de traspassar a planta à terra. Na propagação direta em terra as raízes se desenvolvem melhor mas, em compensação, não é possível visualizar o seu crescimento

Figura: Enraizamento da violeta africana na água e na terra.

03. OBTENÇÃO DE CLONES DE REPOLHO A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES

O gênero Brassica inclui uma enorme variedade de plantas utilizadas na alimentação, seja por suas folhas (repolhos, couve, couve-de-bruxelas), suas flores (couve-flor, brócolos), suas raízes (nabo, couve-rábano), suas sementes (mostarda) ou seu óleo (canola). O repolho comum (Brassicaoleracea var. capitata) se caracteriza por numerosas folhas espessadas e sobrepostas. Dentro da cabeça encontra-se o caule, com uma gema terminal e numerosas gemas axilares bem desenvolvidas como se pode ver na figura abaixo.

O método de clonagem a partir de segmentos nodais consiste no isolamento de um fragmento do caule com gemas axilares e sua transferência a um meio de cultivo apropriado, onde se desenvolverão as plantas-filhas. O método tem sido usado para a propagação vegetativa, tanto in vivo como in vitro, porque permite uma propagação vegetativa rápida dos exemplares considerados mais interessantes.

BIBLIOGRAFIA

AGEE s. Attack of the killer cabbage clones.

RAVEN P.H, EVERT R.F. e EICHHORN S.E. Biologia Vegetal, 6a Edição. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan S.A., 2001.

OBJETIVO

Obter clones de repolho a partir de segmentos nodais com gemas axilares.

MATERIAIS

Uma cabeça de repolho, 1 faca, 1 azulejo ou tábua para cortar, sacolas pequenas do tipo zip loc, papel toalha, um frasco spray com água.

PROCEDIMENTO

1. Colocar várias camadas de papel toalha dentro das sacolas. Umedecer levemente o papel, mediante 3 ou 4 esborrifadas com o frasco spray. CUIDADO! Não colocar água em excesso.

2. Desfolhar a cabeça de repolho, com as mãos. Identificar as gemas axilares e a gema terminal.

3. Cortar o caule em rodelas e colocar cada uma delas em uma sacola, cuidando de não inverter o sentido da polaridade natural da planta como indicado na figura abaixo.

4. Incubar na luz e observar periodicamente.

5. Quantas gemas se desenvolveram? Quanto tempo as gemas demoraram para se desenvolver?

NOSSO COMENTÁRIO

Obtivemos bons resultados seguindo esse procedimento. Também testamos outros materiais como terra, areia e uma mistura de terra e vermiculita. Em todos os casos, as gemas axilares se desenvolveram bem. Tentamos a transferência para a terra, mas apesar de os clones terem sobrevivido um tempo não chegamos a observar nenhum enraizamento. Também transferimos alguns clones para um meio semisólido (0,2 % de Nutrikelp e 0,8% de agar), onde observamos a formação de um calo espetacular.

Para algumas espécies de samambaia a única forma de obter mudas é por divisão de touceiras ou rizomas e posterior plantação na terra. No caso de espécies raras ou quando se precisa de um número alto de mudas o método a seguir é a semeadura de esporos. Em climas temperados ou frios, o melhor momento é o começo da primavera.

A COLETA DOS ESPOROS

Os esporos ficam contidos nos esporângios, que estão agrupados em soros no verso das folhas. A cor marrom quase ferrugem indica que estão maduros. Basta então colocar uma porção da folha num envelope branco e aguardar uma ou duas semanas até visualizar os esporos como uma espécie de poeira.

A SEMEADURA EM TERRA

Preparação do substrato

Regue a terra e coloque plástico transparente por cima, enterrando as bordas. Expor ao sol durante 5 a 6 dias no tempo quente e 10 a 15 dias no tempo mais frio. O calor do sol irá aquecer a terra até 40 ou 50 graus Celsius, eliminando insetos, nematódeos e sementes de ervas daninhas permitindo, porém, que bactérias benéficas para sobrevivam. Adaptado do Boletim Agrário

Semeadura dos esporos

1. No fundo de um vaso baixinho colocar uma camada de pedrinhas e o substrato, previamente tratado.

2. Espalhar os esporos sobre a superfície da terra do vaso através de uma peneira fina ou de um pano do tipo Perfex.

3. Cobrir o vaso com um saco plástico transparente e mantê-lo num pratinho com água em local sombreado.

4. Aguardar uma 6 semanas até observar uma espécie de lodo verde sobre a terra e, mais tarde, os prótalos e as mudinhas.

5. Separar as mudinhas com uma pinça e transferi-las para um recipiente maior.

Observação: do plantio dos esporos até a formação das mudas, podem transcorrer vários meses.

A SEMEADURA EM ÁGAR

O substrato pode ser substituído por um meio mineral simples que habitualmente é utilizado para musgos, solidificado com ágar.

Dissolver em um litro de água destilada os seguintes sais minerais

0,8 g de Nitrato de Amônia (NH3NO3)

0,1 g de Cloreto de Cálcio (CaCl2.2H2O)

0,1 g de Sulfato de Magnésio (MgSO4)

0,46 g de Fosfato Monopotássico (KH2PO4)

0,26 g de Fosfato Dipotássico (K2HPO4)

0,02 g de Sulfato de Ferro (FeSO4.7H2O)

Ajustar o pH a 7 com KOH ou HCl.

Adicionar 15 g de ágar bacteriológico e esquentar até derreter. O ágar derrete quando temperatura passa de 90 graus Celsius e solidifica quando a temperatura desce de 50 graus Celsius.

Esterilizar e distribuir em placas de Petri ou frascos previamente esterilizados.

Observações

Dependendo da precisão das balanças disponíveis e da quantidade de meio a preparar, pode ser necessário preparar soluções-mães ou soluções-estoque.

A contaminação com fungos, cujos esporos vêm com os da samambaia é frequente. Pode-se prevenir aplicando 1 ml de uma solução de fenol 0,5 ou 0, 05 % na superfície do agar o dia anterior à semeadura dos esporos.

05. A CULTURA IN VITRO DE EXPLANTES DE MOSTARDA

Dentro da família Brassicaceae, antigamente denominada Cruciferae, o gênero Brassica compreende um amplo grupo de espécies que inclui o repolho, a couve, o nabo, a couve-flor, a colza, a canola e a mostarda. As mostardas tem grande interesse econômico devido as suas múltiplas utilizações na alimentação e na produção de óleos e gorduras vegetais. Também são aproveitadas como adubo verde e em fitorremediação.

A fins da década de 1980, a Universidade de Wisconsin selecionou diversas variedades de Brassica rapa de desenvolvimento rápido (RCBr ou Fast Plants). Estas plantas-modelo se caracterizam por ter um ciclo de vida curto e precisar pouco espaço, sempre que cultivadas em condições controladas (composição do solo, luz, temperatura). Nos Estados Unidos, as sementes são comercializadas para ensino e pesquisa.

Tivemos acesso a essas plantas em 1992, dentro de uma experiência realizada em paralelo com outras escolas.

Nosso objetivo era comparar o crescimento das Fast Plants e das mostardas comuns. Lamentavelmente, sem a possibilidade de controlar as variáveis ambientais e num calor carioca de 40 graus Celsius, as Fast Plants morreram rapidamente.

Em função do fracasso anterior e da impossibilidade de importar sementes RCBr, a decisão tomada foi de desenvolver as atividades práticas com sementes de Mostarda Lisa (Brassica juncea), vendidas localmente. Essas plantas germinam em 5 a 7 dias e tem um ciclo de vida de 45 a 65 dias. A altura da folhagem é de 35 a 40 cm e a rega, diária.

Uma das aplicações melhor sucedidas é no acompanhamento do desenvolvimento das plantinhas de mostarda a partir do epicótilo, configurando um cultivo de órgãos de fácil realização no laboratório de ensino.

BIBLIOGRAFIA

SCIENCE AND PLANTS FOR SCHOOLS.

OBJETIVO: Acompanhar o crescimento de explantes de mostarda.

MATERIAL

Sementes de mostarda, 1 placa de Petri com meio ágar bacteriológico-água (0,8%), 1 bisturi, 1 pinça, 1 caneta de retroprojetor, uma esponja e um recipiente com água para a germinação das sementes.

PROCEDIMENTO

Obtenção e semeadura dos explantes (Figura 2)

1. Cortar a parte superior das plantinhas e inserir os explantes no meio de ágar-água, sem deixar que os cotilédones fiquem em contato com o meio.

Incubar na luz e acrescentar água quando o meio estiver ressecado e se for necessário, colocar um frasco alto invertido para conservar a umidade.

Observar semanalmente anotando o número de explantes que se desenvolveram e registrando o desenvolvimento de folhas e raízes, uma vez que atinjam um comprimento de 3mm.

Figura 2: Obtenção e semeadura dos explantes

NOSSO COMENTÁRIO

O experimento mostra a importância dos cotilédones que mediante sua capacidade fotossintética asseguram a nutrição da planta até o desenvolvimento das folhas. Por outro lado, a regeneração das raízes mostra a totipotência da planta.

Do ponto de vista do docente, este experimento tem a vantagem de não precisar de condições assépticas nem de meios complexos. Para o aluno a dificuldade reside em realizar um trabalho que exige concentração e minúcia. As imagens mostram o aspecto das placas ao longo do experimento.

COMO MONTAR UM PROJETO

Comparar o desenvolvimento das folhas e o crescimento das raízes em ágar-água e um meio com sais minerais.

Comparar o desenvolvimento de folhas em ágar-água e na terra

Realizar o experimento com outras plantas (rabanete, por exemplo)

As mentas ou hortelãs são plantas perenes, raramente anuais, que se expandem mediante estolões. O fenômeno de hibridização interespecífica, que ocorre naturalmente, dificulta a caracterização das espécies, classificadas no gênero Mentha (família Lamiaceae).

Originárias do Mediterrâneo, as mentas foram introduzidas na Europa pelos Romanos.

Em medicina natural, a menta é utilizada em tisanas, infusões e cataplasmas por suas propriedades estimulantes, carminativas e antiespasmódicas.

Devido a seu aroma e sabor característicos a menta é muito apreciada na culinária. Tanto o seu óleo essencial como o mentol são flavorizantes populares na indústria cosmética e de alimentos (balas e chocolates).

Por outro lado, as propriedades inseticidas do óleo essencial explicam sua inclusão como plantas companheiras na agricultura orgânica.

No Brasil, as espécies mais comuns são a Mentha spicata ou hortelã comum (na foto ao lado), a Mentha piperita ou hortelã pimenta, e a Mentha pulegium ou poejo.

BIBLIOGRAFIA

ACADÉMIE DE TOULOUSE. Culture in vitro de la menthe

HORTAS.

OBJETIVO

Cultivo in vitro da hortelã (Mentha piperita) a partir de segmentos nodais.

MATERIAIS

Uma planta de hortelã, azulejo, faca, 1 frasco com água sanitária diluída à metade, 3 frascos com água estéril, 6 tubos de ensaio ou frascos pequenos contendo meio nutriente estéril, palitos estéreis, bico de Bunsen (opcional).

Observação: O meio nutriente (Murashige&Skoog, Taji ou Knop) é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 700. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 700. Cuidado! O álcool é inflamável. Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

A. ESTABELECIMENTO DE UMA CULTURA ASSÉPTICA

1. Separação dos explantes. Em um azulejo bem limpo, cortar segmentos do caule da hortelã contendo um nó, eliminar as folhas e lavar os explantes.

2. Desinfecção da superfície dos explantes. Passar rapidamente o material por álcool 70% e imergir o explante durante 10 minutos, em uma solução de água sanitária diluída à metade adicionada de 1 gota de detergente. Agitar suavemente durante todo o processo de desinfecção.

3. Lavagens em água destilada estéril. Fazer três lavagens de 1, 3 e 5 minutos, com agitação suave.

4. Estabelecimento da cultura. Em condições assépticas, transferir os explantes aos recipientes com meio nutriente.

5. Incubação. A 20-28 graus Celsius, na luz.

6. Acompanhamento. Registrar semanalmente as observações.

B. REGENERAÇÃO DA PLANTA

Havendo crescimento e sempre em condições asépticas, transferir os explantes a um meio de enraizamento sem água de coco.

Uma vez as raízes desenvolvidas, eliminar por lavado o ágar e transferir a planta para o solo. Controlar a humidade por um tempo e proteger as plantas da iluminação solar indireta até sua adaptação às condições ambientais.

NOSSO COMENTÁRIO

A hortelã comprada no comércio vem muito suja e a pesar do cuidado na desinfecção dos explantes, tivemos um alto número de contaminações. Para contornar esse problema, semeamos Menta piperita em um vaso e retiramos o segmentos nodais das plantas que se desenvolveram.

O protocolo pode ser simplificado. A hortelã não é uma planta exigente e também se desenvolve bem em meio de Knop adicionado de água de coco ou, inclusive, em um meio só com água de coco a 50%. Contudo, até crescerem as folhas é conveniente manter as plântulas em um meio com açúcar.

Em relação à esterilização, pode-se substituir a água destilada estéril dos lavados por Clor-in 10. O único inconveniente é que os explantes ficam grudentos sendo necessário usar um palito estéril para desgruda-los da pinça. Resulta mais fácil se o trabalho for realizado em dupla.

O consumo da raiz da cenoura (Daucus carota, família Apiaceae) data do tempo dos Romanos. Documentos do período medieval mostram que as cenouras eram brancas ou púrpura. No século XVI, uma mutação deu origem a uma variedade de cor laranja, selecionada por horticultores holandeses como homenagem à casa de Orange. Hoje essa variedade é a mais frequentemente encontrada.

Em 1958, cultivando explantes de cenoura em água de coco, dentro de um dispositivo rotatório, F. C. Steward mostrou a totipotência das células vegetais. Esse trabalho inovador abriu as portas para o cultivo de tecidos vegetais e para a regeneração de plantas modificadas por engenharia genética.

BIBLIOGRAFIA

Dodds J.H., Roberts L.W. Experiments in plant tissue culture, third edition. Cambridge, Cambridge University Press, 1995

OBJETIVO: Cultivar explantes de tecidos de cenoura, in vitro.

MATERIAIS

Cenoura, faca, azulejo, frasco desinfetante com água sanitária 50%, 3 frascos com água estéril, pinças, papel toalha, béquer com álcool 950, duas placas de Petri com papel toalha estéril, 4 frascos com meio nutriente estéril *, palitos estéreis, álcool 700, bico de Bunsen (opcional).

Observação: O meio nutriente (Murashige&Skoog ou Taji) é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar bacteriológico (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 70%. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 70%. Cuidado! O álcool é inflamável. Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

Esterilização da superfície da cenoura

1. Em um azulejo bem limpo, cortar com uma faca um pedaço de cenoura de 3 a 6 cm, descartando ambas as extremidades da raiz.

2. Raspar para retirar a epiderme e marcar com algum corte a extremidade inferior da raiz.

3. Desinfetar durante 20 a 30 minutos em água sanitária (hipoclorito de sódio) diluída à metade (50%) e com uma gota de detergente.

4. Lavar 3 vezes em água estéril durante 1, 3 e 5 minutos, tendo a precaução de limpar previamente o frasco e a tampa com álcool.

5. Agitar suavemente durante todo o procedimento.

Obtenção dos explantes

1. Sempre em condições assépticas, transferir o pedaço de cenoura a uma placa de Petri com papel toalha estéril para eliminar as partes queimadas, com uma faca ou bisturi estéril.

2. Transferir novamente o pedaço de cenoura a uma segunda placa de Petri com papel de filtro estéril e cortar uma rodela fina de 1 a 2 mm de espessura.

3. Separar o cilindro vascular e corta-lo em 4 partes, como indicado abaixo:

Estabelecimento da cultura : Em condições assépticas, semear os quatro explantes mantendo a polaridade, nos frascos com meio nutriente.

Incubação: A 25 graus Celsius, na escuridão.

Subcultura ou repique: Sempre em condições assépticas, descartar mensalmente o tecido necrosado e transferir os explantes a meio novo. Depois de um tempo, transferir os explantes a um meio nutriente contendo sais minerais e sem água de coco, e incubar na luz.

NOSSO COMENTÁRIO

Trata-se de um experimento clássico, que dá bons resultados. A maior dificuldade está na obtenção do explante, porque uma vez que se utiliza um meio contendo sacarose e água de coco, o trabalho terá que ser muito rigoroso para manter as condições assépticas e evitar as contaminações.

Por outro lado, como pode resultar difícil diferenciar o crescimento incipiente do calo de uma contaminação bacteriana, acrescentamos na figura 2 várias imagens de calos em diversas etapas de desenvolvimento. É preferível aguardar um pouco antes de eliminar o material.

COMO MONTAR UM PROJETO

A cenoura não é a única raiz que pode originar calos. Testar com outras raízes de dicotiledôneas, como por exemplo, batata doce (Ipomoea batatas), ou batata inglesa (Solanum tuberosum).

Comparar o crescimento e diferenciação dos tecidos em meios de diferente composição.

Figura 2. Calos de cenoura

A: Início da formação do calo; B: proliferação de um tecido esbranquiçado opaco; C: fragmento original do explante rodeado de tecido não diferenciado; D: transferido a um meio sem água de coco e incubado na luz, o explante está coberto pelo calo no qual se observa um fragmento vermelho (produção de pigmento?) e um fragmento esverdeado (atividade fotossintética?).

A batata (Solanum tuberosum, família Solanaceae) é uma planta originária da região andina. No século XVI chegou à Europa onde, depois de vencer a resistência da população, transformou-se em um dos poucos alimentos consumidos pela população mais pobre.

A meados do século XIX, o fungo Phytophtora infestans infectou a batata, desencadeando-se na Irlanda um terrível período de fome, que causou a morte de um milhão de pessoas e a emigração de boa parte da população.

Hoje, a batata é o quarto cultivo mais importante do mundo.

Figura 1. Produção de tubérculos de batata, segundo Mantell et al. Princípios de Biotecnologia em plantas. Ribeirão Preto, Sociedade Brasileira de Genética, 1994

"As plantinhas produzidas na unidade de cultivo de tecidos são transferidas para casas de vegetação onde são irrigadas com um vaporizador de água. Os tubérculos obtidos são plantados em viveiros protegidos ou em lotes isolados. Depois de testes rigorosos de controle de vírus, os estoques elite certificados são liberados para os produtores. Os agricultores credenciados produzem novos tubérculos, que podem ser então certificados e liberados para produtores comerciais. A venda de tubérculos certificados para produtores credenciados pode, muitas vezes, financiar uma unidade de cultura de tecidos e instalações conexas."

OBJETIVO: Cultivar batata a partir de gemas brotadas, in vitro.

MATERIAIS

Batata brotada, azulejo, faca, 1 frasco com solução desinfetante de hipoclorito de sódio (água sanitária comercial diluída à metade), 3 frascos com água estéril, 6 tubos de ensaio contendo meio nutriente* com água de coco estéril, palitos esterilizados, álcool 70%, bico de Bunsen (opcional).

Observação: O meio nutriente é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar bacteriológico (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 700. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 70%. Cuidado! O álcool é inflamável! Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

Separação dos explantes. Em um azulejo bem limpo, dissecar com uma faca os brotos de batata de modo a separar fragmentos de aproximadamente 1,5 cm.

2. Desinfecção dos explantes. Imergir o explante em uma solução desinfetante de hipoclorito de sódio (água sanitária diluída à metade) com 1 gota de detergente, durante 10 minutos, agitando suavemente.

Lavagens em água destilada estéril. Três lavagens de 1, 3 e 5 minutos, agitando suavemente.

4. Estabelecimento da cultura. Em condições assépticas, em tubos de ensaio contendo meio nutriente básico MS + sacarose (3% m/v) + ágar (0,7-0,8%) + água de coco.

5. Incubação. A 20-25 graus Celsius, na luz

6. Acompanhamento. Registrar semanalmente as observações.

NOSSO COMENTÁRIO

Esta atividade deve ser prevista com bastante antecipação. Escolher no comércio local batatas sem nenhuma alteração visível, que serão lavadas cuidadosamente e colocadas no escuro, na parte inferior da geladeira, até brotarem.

A desinfecção é crítica, mas a manipulação é relativamente simples e os resultados podem ser espetaculares, mostrando inclusive o crescimento de pequenos tubérculos (Figura 2).

COMO MONTAR UM PROJETO

Comparar o crescimento in vitro das gemas de batata com meios de cultivo de diferente composição.

A couve-flor (Brassica oleraceae var. botrytis, família Brassicaceae) é uma variedade da couve silvestre, originada no Mediterrâneo oriental entre 1500 e 2000 anos atrás. Trata-se de uma planta herbácea bienal, que se reproduz por sementes. A parte comestível (“cabeça”) é uma inflorescência imatura arredondada, inserida em um caule curto.

A cor é branca, amarela ou creme, mas também são comercializadas couves-flores verdes ou roxas. Por ser um órgão meristemático, a cabeça desenvolve caules com flores amarelas ou brancas quando a planta amadurece. Essas inflorescências podem chegar a medir 100 cm.

Em condições experimentais, os meristemas revertem para a fase vegetativa e se desenvolvem como brotos folhados. As plantas regeneradas a partir desses brotos se usam para a produção de sementes.

Por ser um material barato e fácil de obter, vários protocolos para o cultivo in vitro da couve-flor no laboratório de ensino circulam na Web. As poucas diferenças entre eles parecem depender da estrutura do laboratório e da experiência pessoal. Pode-se substituir a couve-flor por brócolis, que é outra variedade de Brassica oleraceae da qual se consomem os botões florais.

BIBLIOGRAFIA

THE ASSOCIATION FOR SCIENCE EDUCATION. Experimenting with industry. 13. Plant Tissue Culture. SCSST, 1985.

OBJETIVO

Cultivo in vitro da couve-flor a partir dos meristemas preflorais.

MATERIAIS

Couve-flor ou brócoli, azulejo, faca, 1 frasco com água sanitária diluída à metade, 3 frascos com água estéril, placa de Petri com papel toalha estéril, bisturi estéril, 6 tubos de ensaio ou frascos pequenos contendo meio nutriente* estéril, palitos estéreis, bico de Bunsen (opcional).

Observação: O meio nutriente é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar bacteriológico (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 70%. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 70%. Cuidado! O álcool é inflamável. Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

A. ESTABELECIMENTO DE UMA CULTURA ASSÉPTICA

1. Separação dos explantes: Em um azulejo bem limpo, dissecar com uma faca várias florezinhas de couve-flor (tamanho 3 x 5 x 5 mm). Lavar muito bem esses explantes.

2. Desinfecção da superfície dos explantes: Passar rapidamente o material por álcool 70% e mergulhar o explante durante 10 minutos, em uma solução de água sanitária diluída à metade adicionada de 1 gota de detergente. Agitar suavemente durante todo o processo de desinfecção.

3. Lavagens em água destilada estéril: Fazer três lavagens de 1, 3 e 5 minutos, com agitação suave.

4.Estabelecimento da cultura: Em condições assépticas, transferir os explantes aos recipientes com meio nutriente.

5. Incubação : A 20-28 graus Celsius, na luz.

6. Acompanhamento : Registrar semanalmente as observações.

B. REGENERAÇÃO DA PLANTA

Havendo crescimento e propagação, dividir o material e transferi-lo a um meio fresco, de modo a obter numerosas subculturas. Uma vez desenvolvidas, transferir em condições assépticas as plântulas das subculturas para um meio de enraizamento sem água de coco onde, além de desenvolver raízes, enrijecerão e começarão a fotossintetizar.

Antes de transferir a planta para o solo, eliminar por lavado o ágar e os vestígios de açúcar. Controlar a humidade por um tempo e proteger as plantas da iluminação solar direta até sua adaptação às condições ambientais.

NOSSO COMENTÁRIO

A primeira medida é procurar no comércio uma couve-flor fresca, compacta e firme, sem manchas amarronzadas. Em caso de não encontrar, procurar um brócoli.

A segunda é uma boa desinfecção do explante, em água sanitária diluída à metade. Mesmo com uma aparência boa, uma couve-flor proveniente da prateleira de um supermercado pode estar muito contaminada, sendo às vezes necessário aumentar o tempo de imersão no desinfetante e lavar com Clor-in em vez de água destilada estéril. Depois desse tratamento convém cortar a extremidade queimada do explante.

Contudo e a pesar de todos os cuidados, as contaminações poderão aparecer uma semana depois da semeadura, uma vez que o explante crescer e começar a se abrir permitindo o contato com o meio de reentrâncias que não foram alcançadas pelo desinfetante.

As culturas e subculturas bem estabelecidas são espetaculares (Figura 2). Além do crescimento de folhas e raízes, em alguns casos se observa a aparição de antocianinas que dão ao explante uma cor roxa muito bonita (Figura 3).

COMO MONTAR UM PROJETO

Comparar o crescimento com diferentes meios.

O alho (Allium sativum, família Amaryllidaceae) é uma monocotiledônea, originária da Ásia. O bulbo, ou cabeça d’alho, está formado por bulbilhos ou dentes d’alho (Figura).

Devido às propriedades aromáticas conferidas pela alicina, esses bulbilhos tem-se tornado um condimento indispensável na culinária de vários povos. Com algumas propriedades antimicrobianas, o alho também é utilizado na medicina popular para o controle da pressão sanguínea, do colesterol, da doença coronária e da aterosclerose.

A propagação é assexuada, a partir dos bulbilhos. No alho-semente, consegue-se eliminar os vírus por cultivo in vitro dos meristemas próximos ao disco caulinar basal. Existem diversas estratégias de melhoramento genético, baseadas na informação existente nos Bancos de Germoplasma.

Figura: O alho (Allium sativum).

Acima: cabeça d’alho; no meio: corte da cabeça d’alho; abaixo: corte longitudinal de um dente d’alho, mostrando o disco caulinar basal.

BIBLIOGRAFIA

Peat G. and Jones M. A protocol for rapid, measurable plant tissue culture using stem disc meristem micropropagation of garlic (Allium sativum L.). SSR 93(345), 2012.

OBJETIVO: Cultivar, in vitro, explantes de disco caulinar basal de alho.

MATERIAIS

Um dente d’alho, bisturi ou faca afiada, azulejo, frasco desinfetante com água sanitária diluída à metade, 3 frascos com água destilada estéril, pinças, papel toalha, uma placa de Petri com papel toalha estéril, 4 frascos com meio nutriente estéril *, palitos estéreis, álcool 70%, bico de Bunsen (opcional).

Observação: O meio nutriente é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar bacteriológico (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 70%. Cuidado! O álcool é inflamável. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 70%. Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

1. Separação dos explantes: Descascar o bulbilho (dente de alho) e cortar rente à parte seca da base, como observado na figura.

2. Desinfecção da superfície dos explantes : Esterilizar o bulbilho por imersão, durante 20 minutos, em água sanitária diluída à metade adicionada de uma gota de detergente.

3. Lavagens em água destilada estéril: Fazer 3 lavagens de 1, 3 e 5 minutos, agitando suavemente.

4. Estabelecimento da cultura: Em condições assépticas, levar os dentes d’alho a uma placa de Petri contendo papel toalha estéril.

Com um bisturi afiado, separar uma lâmina de 2 mm no disco basal e cortá-la ao meio. Transferir os dois explantes para o frasco com meio de cultivo estéril, mantendo a polaridade de um dos fragmentos e invertendo a do outro.

5. Acompanhamento: Observar semanalmente o crescimento dos explantes.

NOSSO COMENTÁRIO

Em relação à bibliografia citada, respeitamos a indicação de colocar os dentes d’alho na geladeira durante pelo menos uma semana antes de dar início à atividade prática. Não acrescentamos o antifúngico Nipagin (metilparabeno) nos lavados, como recomendado pelos autores.

A vantagem de começar pela esterilização do dente d’alho está em conseguir eliminar logo os contaminantes. Mesmo que o processo danifique os tecidos externos, isso não parece afetar a lâmina caulinar basal que está dentro do bulbilho.

Esta atividade exige tempo de preparação, porque demanda bastante material estéril, mas o resultado é excelente. Após algumas semanas, observamos o crescimento dos explantes de alho, a partir da região meristemática do disco basal do bulbilho (Figura 2)

O milho (Zea mays) é um cereal da família Graminaceae originária do continente americano e atualmente cultivada em quase todo o mundo. Como em todas as monocotiledôneas o cotilédone tem como função a transferência dos nutrientes do endosperma à plântula em desenvolvimento.

No cultivo in vitro o meio nutriente substitui o endosperma, já que o embrião é retirado junto com o cotilédone (Figura 1). Esta modalidade de cultivo in vitro permite resgatar embriões híbridos, resultantes de cruzamentos incompatíveis. Também se utiliza para quebrar a dormência das sementes, encurtando assim o ciclo de vida de algumas plantas. Trata-se de um bom modelo para os estudos fisiológicos ligados à germinação da semente e ao desenvolvimento das plântulas.

Assim como outros órgãos das plantas, os embriões podem ser cultivados em um meio nutriente contendo água, sais minerais, açúcar e ágar.

Figuras: O milho e a estrutura do grão.

BIBLIOGRAFIA

MY AGRICULTURE INFORMATION BANK

SHOESTRING BIOTECHNOLOGY. National Association of Biology Teachers (NABT)

OBJETIVO: Cultivar embriões de milho, in vitro.

MATERIAIS

Uma espiga de milho, tubos de ensaio com meio nutriente* estéril, 1 faca ou 1 bisturi, palitos estéreis, água sanitária diluída à metade, 3 frascos de água destilada estéril, álcool 960, álcool 700, bico de Bunsen (opcional).

O meio nutriente (Murashige&Skoog, Taji ou Knop) é uma solução de sais minerais às quais se adiciona sacarose (1 a 5%), ágar (0,7%) e água de coco, como indicado nos FUNDAMENTOS TÉCNICOS.

PROCEDIMENTO

A limpeza do lugar de trabalho é fundamental, assim como a higiene das mãos. O lugar de trabalho será desinfetado com álcool 70%. Os participantes lavarão muito bem as mãos e os antebraços com água e sabão, antes de passar álcool 700. Cuidado! O álcool é inflamável. Esterilizar o material contaminado antes de descarta-lo.

O trabalho envolve pelo menos dois participantes que chamaremos de A e B

1. Desinfecção dos explantes.

Separar com uma faca os grãos de milho. Desinfetar os grãos com a solução de água sanitária (15 minutos), agitando suavemente. Lavar os grãos três vezes com água destilada estéril (1, 3 e 5 minutos).

Em repetições posteriores desta atividade, desinfetamos os grãos de milho com álcool e com Clor-in 10 sem que fosse observado um aumento significativo das contaminações.

2. Extração do embrião

Com muito cuidado, pressionar suavemente o grão de milho para facilitar a saída do embrião. Colher o embrião com um palito estéril (Participante A). O procedimento pode ser visto no vídeo Extração e semeadura do embrião de milho.

3. Semeadura do embrião

Abrir o tubo de ensaio contendo meio de cultivo estéril e flambar a boca do tubo (Participante B). Deixar cair o embrião dentro do tubo (Participante A). Flambar novamente a boca do tubo e fecha-lo (Participante B). A seguir, verificar que o embrião se encontre em contato com o meio. Se não for assim, agitar suavemente o tubo de modo a acomodar o embrião no meio.

4. Incubação

Na luz, a temperatura ambiente.

5. Estabelecimento da cultura

Acompanhar semanalmente medindo a altura (mm) do epicótilo.

NOSSO COMENTÁRIO

Este protocolo está baseado no trabalho de conclusão do Curso Médio Técnico de Biotecnologia de Tassia Torres Furtado, Vania Carolina Fonseca da Silva e Vítor Soares Mann intitulado “Cultivo de embriões de milho”, desenvolvido em 2002.

Os autores não encontraram dificuldades no acompanhamento do crescimento do embrião (Figura 2). Eles trabalharam com dois meios alternativos, meio básico Taji e meio de coco, descritos nos Fundamentos Técnicos. Os resultados podem ser apreciados no gráfico 1, mostrando que os embriões de milho se desenvolveram melhor no meio básico Taji que no meio de coco. O meio Taji parece ter esgotado mais tarde (3 semanas) que o meio de coco (2 semanas).

COMO MONTAR UM PROJETO

Alterar a composição do meio de cultivo

Pesquisar o crescimento in vitro de embriões de outras monocotiledôneas.

12. KALANCHOE DAIGREMONTIANA: UMA PLANTA MODELO

O gênero Kalanchoe (família Crassulaceae, ordem Saxifragales) apresenta algumas interessantes adaptações a climas áridos e quentes, tais como a abertura noturna dos estómatos. Estes permanecem fechados durante o dia, reduzindo a perda de água. O processo fotossintético se caracteriza por um mecanismo alternativo de fixação de carbono, denominado metabolismo ácido das Crassuláceas (CAM).

À noite, quando as plantas abrem os estómatos, o carbono (CO2) é fixado sob a forma de ácidos. De dia, quando os estómatos estão fechados e a luz fornece o ATP e o NADPH para o ciclo de Calvin, o CO2 é liberado dos ácidos orgânicos e incorporado como açúcar. As plantas CAM mantém uma divisão temporal entre a fase luminosa da fotossíntese e o ciclo de Calvin.

No gênero Kalanchoe encontramos espécies que se reproduzem sempre sexualmente, formando flores e sementes. Também encontramos espécies que podem se reproduzir assexualmente mediante a formação, nas margens das folhas, de embriões e plântulas que ao se desprender e cair no solo, geram as plantas-filhas.

Em algumas espécies, como Kalanchoe beharensis (orelha de elefante), portadoras de uma versão do gene LEC1 que permite a formação de sementes, a produção de embriões foliares só acontece induzida por condições de stress. Em outras, como Kalanchoe daigremontiana, portadoras de uma mutação no gene LEC1 que não lhes permite formar sementes, a reprodução assexual é constitutiva (obrigatória).

Os Kalanchoes apresentam algumas propriedades medicinais e inseticidas, de modo que podem resultar tóxicas quando ingeridas por crianças ou animais de pequeno porte.

No laboratório de ensino, adotamos Kalanchoe daigremontiana como planta modelo porque permite desenvolver sem maiores contratempos todos os estágios da micropropagação: obtenção dos explantes, desinfecção e semeadura in vitro; multiplicação mediante sucessivas subculturas, transferência à terra e aclimatação.

Bibliografia

BIBLIOGRAFIA

GARCÊS H. M. P. et al. Evolution of asexual reproduction in leaves of the genus Kalanchoe. PNAS 104:39,2007

OBJETIVO

Reproduzir os principais estágios da micropropagação (Ver FUNDAMENTOS TÉCNICOS).

MATERIAIS

Uma planta de Kalanchoe daigremontiana, frascos ou tubos de ensaio com meio de cultivo* estéril, 1 azulejo limpo, 1 peneira, 1 pinça, 1 faca ou bisturi, álcool 700, Clorin 10 (Dicloro-S-Triazinetrione de sódio; 10,1 em cloro ativo) **, béquer de 1 litro, água destilada, copos plásticos pequenos com terra de jardim, filme de PVC (Rolopac), vasos com terra de jardim.

* O meio de cultivo é uma solução de sais minerais gelificado com ágar (0,7%). Não é necessário acrescentar sacarose ou açúcar cristal, nem água de coco.

** Clor-in 10 é um produto comercial para a desinfecção de hortifrutícolas. Dissolver uma pastilha em 500 ml de água, como indicado pelo fabricante. Não é necessário enxaguar. Utilizar água destilada na desinfecção dos explantes e água da torneira para desinfetar a peneira.

PROCEDIMENTO

Estágio 1: Separação dos explantes e semeadura in vitro

Antes de começar: Desinfetar a pinça em álcool 70% e a peneira por imersão de pelo menos 20 minutos em uma solução de Clor-in 10, preparada dissolvendo uma pastilha em 500 ml de água.

1. Separar os explantes: retirar embriões foliares da planta ou cortar alguns fragmentos de folha.

2. Desinfetar os explantes por imersão na solução de Clor-in 10.

3. Eliminar com a peneira a solução desinfetante, retendo os explantes.

4. Com a pinça, transferir os explantes aos frascos contendo o meio de cultivo.

5. Incubar os explantes na luz, a temperatura ambiente.

13. MICROPROPAGAÇÃO: NOÇÕES BÁSICAS

Autores: Maria Antonia Muñoz de Malajovich e Vítor Soares Mann

FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS

A reprodução assexual é utilizada para obter um número de mudas a partir de uma única planta. Dependendo do caso, aproveitam-se bulbos (cebola), cormos (gladíolo), rizomas (samambaias), tubérculos (batata-inglesa), caules (banana), raízes (batata-doce, maçã, amora), folhas (begônia, espada-de-são-jorge), estacas (videiras) etc. As plantas obtidas por propagação assexuada ou vegetativa são idênticas à planta-mãe e idênticas entre si. Em outras palavras, são clones.

Denomina-se totipotência a capacidade de uma célula regenerar réplicas do organismo do qual ela deriva. Restringida em animais, esta propriedade característica das plantas permite a sobrevivência em condições ambientais desfavoráveis ou após o ataque de herbívoros, pragas e patógenos.

A cultura in vitro ou micropropagação se inicia com a extração de pequenos fragmentos de tecido retirados de diversas partes da planta, tais como folhas, raízes, segmentos nodais e gemas axilares, gemas florais e apicais

Uma vez limpos e desinfetados, os explantes são transferidos em condições assépticas a um meio de cultura adequado. Subculturas periódicas desses explantes permitem a amplificação do material e, mais tarde, sua diferenciação de modo a regenerar a planta inteira.

POR QUE ENSINAR AS TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO?

A cultura (ou cultivo) in vitro pode ser desenvolvida inicialmente em espaço reduzido e independentemente de fatores climáticos e épocas do ano. Calcula-se que 10 m2 de prateleiras são suficientes para o cultivo de 20.000 plantinhas. O número de indivíduos produzido por cultura in vitro é muito maior do que o número de indivíduos que poderia ser obtido pelo método de multiplicação tradicional. O cultivo de uma gema de eucalipto pode originar em um ano 75 trilhões de mudas em vez das 100 ou 200 que são obtidas habitualmente por estaquia. Estes resultados são de grande interesse para as indústrias de papel, celulose e madeiras.

A cultura in vitro possibilita a produção e distribuição de mudas livres de patógenos a partir de tecidos meristemáticos, que não são infectados por vírus. Um exemplo é a produção de tubérculos de batata livres de vírus para inclusão em programas de certificação de batata-semente.Também permite a produção de sementes sintéticas, que consistem em um embrióide formado a partir de uma massa de tecidos obtida in vitro, envolvido em uma substância gelatinosa com nutrientes e coberto por um plástico biodegradável. O conjunto constitui uma semente artificial que se desenvolve normalmente quando semeada na terra. Lançadas desde aviões, estas sementes facilitam o reflorestamento em regiões degradadas de difícil acesso.

As técnicas de cultura in vitro de vegetais foram rapidamente assimiladas por empresas e instituições de pesquisa e desenvolvimento, porque facilitam o melhoramento genético das variedades comerciais e, também, porque representam uma etapa indispensável na obtenção de uma planta transgênica.

Sendo técnicas de domínio público, relativamente simples e de baixo custo, numerosas empresas as utilizam, no mundo todo, para garantir a qualidade genética e fitossanitária das mudas e sementes comercializadas. Esta tecnologia está amplamente difundida na América Latina, onde representa o segundo produto mais comercializado da biotecnologia agrícola, com ampla difusão na olericultura, na hortifruticultura, na floricultura e na propagação de plantas ornamentais, assim como na produção de plantas de interesse industrial (cana, café) e de mudas de essências florestais para as indústrias de papel.

REQUERIMENTOS MÍNIMOS

Os complexos protocolos de pesquisa publicados nas revistas especializadas exigem reagentes ou condições de trabalho inabituais no laboratório de ensino, mas isso não significa que seja impossível desenvolver algumas atividades. Graças a um movimento do tipo DIY (do-it yourself), conduzido por pessoas amantes das plantas e da jardinagem, hoje encontramos na Internet protocolos simples e vídeos entusiastas mostrando como proceder para o cultivo in vitro caseiro de algumas plantas (HOME TISSUE CULTURE; kitchen experiments).

Quais os requerimentos mínimos? Um canto de laboratório limpo, uma panela de pressão, numerosos frascos de maionese ou de marmelada com suas respectivas tampas, alguns reagentes para a preparação dos meios, um estereomicroscópio ou lupa binocular, e um lugar com iluminação indireta para a incubação dos cultivos.

Um aparelho de fluxo laminar é bem-vindo, mas também se pode trabalhar dentro de uma caixa plástica (50cm x 40cm x 40 cm) previamente desinfetada. Com esses materiais e sabendo manter a assepsia, é possível dar início a vários experimentos simples de cultivo de tecidos vegetais.

Diferente das técnicas de propagação vegetativa, as técnicas de cultura de tecidos vegetais representam, no laboratório de ensino, um desafio considerável para o Professor: baixa repetitividade, vasto trabalho de preparação e numerosas contaminações. A lentidão no crescimento dos explantes pode ser decepcionante para quem esteja acostumado a lidar com resultados imediatos. Contudo, são essas dificuldades que as tornam mais interessantes.

O tradicional meio de sais minerais de Murashige & Skoog pode ser substituído por meios alternativos.. Contudo, apesar de esterilizar os meios e trabalhar em condições assépticas, a contaminação dos cultivos por bactérias e fungos é um problema difícil de resolver. Os resultados melhoram significativamente com a adição nos meios de cultivo de PPM™ (Plant Preservative Mixture), um produto que pode ser esterilizado e, em baixa concentração (0,05 a 0,2%), não afeta o crescimento dos explantes. Com algumas indicações básicas e protocolos de complexidade variável podem ser obtidos resultados espetaculares.

OS EXPERIMENTOS

Cultura in vitro de embriões

As sementes germinam e se desenvolvem no meio de cultivo até o momento da transferência a terra. Esta técnica é aplicada comercialmente para a produção de orquídeas, mas no laboratório de ensino convém começar com sementes maiores e que germinem mais rápido.

Tivemos bastante sucesso com o cultivo in vitro de embriões de milho. Nesta modalidade trata-se de separar os embriões do resto da semente e transferi-los ao meio de cultivo.

Cultura in vitro de órgãos isolados

O explante pode ser extraído de um tecido (meristemas) ou de um órgão (gemas ou brotos, raízes, anteras etc.). A capacidade de regeneração diminui com a idade da planta e depende também do genótipo e das condições ambientais. Maior nas plantas herbáceas que nas lenhosas, essa capacidade está distribuída em forma desigual entre algumas famílias de Solanáceas, Crucíferas, Gesneriáceas, Compostas e Liliáceas.

Na literatura correspondente, a violeta africana (Saintpaulia) figura como planta modelo, por ser fácil de cultivar por propagação vegetativa e adequada para os estudos morfológicos. Contudo, encontramos que as folhas são muito difíceis de desinfetar e tivemos melhores resultados com as folhas e os embriões foliares de Kalanchoe daigremontiana (Bryophyllum). Também conseguimos resultados satisfatórios com brotos de batata-inglesa, raízes de ervilha, gemas de repolho e flores de couve-flor e de brócolis.

Cultura in vitro de calo

Um calo é uma massa de células desdiferenciadas que cresce a partir de um explante. Uma vez estabelecido em um meio de cultivo, o calo pode ser subdividido a cada três ou quatro semanas e mantido indefinidamente em meio nutriente de igual composição. Sua transferência a meios de cultivo com diferentes concentrações de hormônios induz a embriogênese e/ou a organogênese. No laboratório de ensino, cenouras e batatas-doces fornecem calos espetaculares.

Cultura in vitro de células isoladas

Os cultivos de células isoladas em meio líquido visam a produção de metabólitos secundários em fermentadores industriais (alcaloides, perfumes, enzimas, hormônios etc.). Até o momento não realizamos nenhum experimento desse tipo, mas já obtivemos protoplastos por digestão enzimática da parede celular.

OS PROCEDIMENTOS

Um treinamento básico em técnicas microbiológicas facilita a tarefa.

O passo inicial é a preparação do meio de cultivo. Além de meios complexos existem meios alternativos de formulação simples e baixo custo. Também é indispensável verificar que todo o material se encontre pronto e esterilizado, incluídos os instrumentos que serão usados.

Deve-se desinfetar o lugar de trabalho com álcool 96%. Também é recomendável lavar bem as mãos e os antebraços com água e sabão e, finalmente, passar álcool 70%. A menos de ter uma boa prática microbiológica, evitar o flambado no bico de Bunsen (o álcool é inflamável) substituindo-o na desinfecção de instrumentos pela imersão em álcool ou água sanitária.

Antes de iniciar os procedimentos, prender o cabelo além de retirar relógios ou anéis. Uma boa organização do lugar de trabalho é determinante para o sucesso das atividades. Durante os procedimentos, usar luvas descartáveis nas quais eventualmente se passará álcool e uma máscara cirúrgica e, fundamentalmente, não falar nem passar os braços sobre os explantes ou por cima de frascos abertos contendo meio. Evitar também o abrir e fechar de portas e a circulação de pessoas no recinto.

Todo o material contaminado será esterilizado e, posteriormente, eliminado.

Obtenção dos explantes

Limpar cuidadosamente com água e sabão o material escolhido (folhas, caules, raízes etc.), dando preferência às partes jovens e saudáveis.

Desinfecção da superfície do explante

Mergulhar o material retirado da planta-mãe em etanol 700, durante um a dois minutos, antes de desinfetá-lo com um agente químico como o hipoclorito de sódio (NaClO com 0,5-1% de matéria ativa) em solução, na qual será acrescentada uma gota de detergente.

A concentração da solução de hipoclorito e o tempo necessário para a desinfecção variam com o tipo de explante. A função do detergente é diminuir a tensão superficial, favorecendo o contato entre o explante e o desinfetante. A agitação suave e continua durante o processo cumpre a mesma função.O hipoclorito de sódio será eliminado mediante três lavados com água destilada estéril. A seguir, pode ser necessário uma dissecção em condições assépticas para eliminar as partes danificadas dos explantes.

Transferência ao meio de cultura

O meio de cultura pode estar distribuído em tubos de ensaio, em placas de Petri ou em frascos de diversos tamanhos. Transferir os explantes em condições assépticas, semelhantes às utilizadas para a cultura de microrganismos. Devido à composição do meio, nem a umidade nem a disponibilidade de água são fatores limitantes. Para garantir a aeração do cultivo e uma boa oxigenação, na falta de material específico, se substituem-se as tampas dos frascos por filme de PVC.

Incubação

A uma temperatura entre 23 e 28 graus Celsius, na luz durante 12 a 14 horas diárias ou no escuro, dependendo do explante.

SEGUNDO OBJETIVO: REGENERAR UMA PLANTA

Uma vez dominada a técnica para o estabelecimento de culturas assépticas, os três próximos passos para regenerar uma planta são a multiplicação dos propágulos, a preparação das plântulas para a transferência ao solo e aclimatação.

Multiplicação

Havendo crescimento e propagação, dividir o material é transferi-lo a um meio fresco, de modo a obter numerosas subculturas. Em alguns casos, basta alterar a composição do meio para estimular a diferenciação. Sempre em condições assépticas.

Preparação das plântulas para a transferência ao solo

Em condições assépticas, transferir as plântulas das subculturas para um meio de enraizamento onde, além de desenvolver raízes, enrijecerão e começarão a fotossintetizar. Em alguns casos se elimina o açúcar do meio.

Aclimatação

Quando o desenvolvimento da planta justifica seu traspasso a terra, eliminam-se por lavado o ágar e os vestígios de açúcar. Transfere-se a planta primeiro para o solo ou para algum outro substrato, mais tarde para uma casa de vegetação. Protegidas da iluminação solar direta, elas aumentarão sua capacidade fotossintética adaptando-se lentamente as condições ambientais.

VALE A PENA?

Com certeza.

BIBLIOGRAFIA BÁSICA

DODDS J.H E ROBERTS L.W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge, Cambridge University Press, 1995.

FAO – FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION / IAEA -INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY

HOME TISSUE CULTURE GROUP.

KYTE L. E KLEYN J. Plants from test tubes – 3th edition. Portland, Timber Press Inc., 2009.

MANTELL S.H., MATTHEWS J.A. E McKEE R.A. Princípios de biotecnologia em plantas. Ribeirão Preto, Sociedade Brasileira de Genética, 1994.

PIERIK R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, 1990.

RAVEN, et al. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 2001.

SMITH R.A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, National Association of Biology Teachers, 1997.

TORRES A.C. ET AL. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Vol.1. Brasília, EMBRAPA-CNPH, 1998.

AGRADECIMENTOS

Aos técnicos e alunos que colaboraram na preparação e montagem dos experimentos de micropropagação.

14. A COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTIVO

Os meios de cultivo incluem água, uma fonte de carbono, substâncias inorgânicas (sais minerais), vitaminas, hormônios e fatores reguladores do crescimento. Geralmente, o pH do meio é mantido entre 5,0 e 6,5.

Água destilada

Representa 95% do meio nutriente.

Fonte de carbono

Geralmente se utiliza sacarose. A fonte de carbono é necessária porque os explantes não são totalmente autotróficos e a fotossíntese in vitro não supre as necessidades das células.

Substâncias inorgânicas

Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) e microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), em uma proporção que depende da planta escolhida.

Vitaminas

Mioinositol, vitamina B1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B6 (piridoxina), pantotenato de cálcio, ácido fólico, vitamina B2 (riboflavina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico e vitamina E (tocoferol).

Hormônios e reguladores de crescimento

Auxinas. Estas promovem o alongamento celular, a formação de calos e de raízes adventícias; inibem a formação de brotos axilares adventícios e, às vezes, a embriogênese em suspensões celulares. Exemplos: IAA (ácido indolacético), NAA (ácido naftalenoacético), IBA (ácido indolbutírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético).

Citocininas. Estas promovem a divisão celular, regulam o crescimento e o desenvolvimento dos tecidos vegetais. Exemplos: cinetina, 2iP (2-isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina.

Outras substâncias. Exemplos: giberelinas, ácido abcíssico, etileno.

Misturas de substâncias pouco definidas

Extrato de levedura, extratos vegetais, hidrolisados de caseína, peptona e triptona. A tendência atual em pesquisa é de substituí-los por meios de composição definida.

Materiais inertes utilizados como suporte

Ágar, agarose, outros polissacarídeos (Gelrite, Phytagel), lã de vidro, papel de filtro, areia, esponjas de poliestireno.

Existem diferentes formulações, das mais sofisticadas às mais simples, sendo a mais antiga a solução de Knop, que ainda hoje é utilizada como base para os estudos sobre os macronutrientes necessários para as plantas. Atualmente, se admite que a composição de um meio deve ser ajustada às necessidades de cada espécie.

Um dos meios mais utilizados é o de Murashige & Skoog (M&S), uma mistura complexa de sais complementada com vitaminas, à qual se acrescentam sacarose e ágar. Por ser bastante concentrado, às vezes é usado em diluição 50%. Sua preparação figura no Guia 15 (Os meios de cultivo clássicos).

O crescimento e a diferenciação celular são controlados in vitro mediante modificações na proporção entre os hormônios e reguladores de crescimento. De um modo geral, se a proporção entre citocininas e auxinas for maior que 1, desenvolvem-se brotos, se for menor, raízes e, se for igual, calos.

Contudo, a necessidade de utilizar meios bem definidos se aplica fundamentalmente à pesquisa científica. Para o horticultor ou para o docente essa necessidade é menor e, em muitos casos, os meios alternativos são suficientes para obter bons resultados.

Alguns autores (Taji, Bridgen) desenharam meios alternativos de composição simples: fertilizante NPK 10:10:10 e vitaminas. No laboratório de ensino, tivemos bons resultados com o meio Taji. A informação sobre sua preparação se encontra no Guia 16 (Os meios de cultivo alternativos).

A sacarose pode ser substituída por açúcar cristal, em uma proporção de 2 a 3%. O meio é solidificado com ágar bacteriológico na concentração 0,6-0,8%. Também pode-se experimentar outros materiais (amido, bolinhas de vidro, compost, ponte de papel de filtro, areia etc.).

Excetuando o hormônio de enraizamento que é barato e fácil de encontrar nas floriculturas, o preço da maioria dos fatores de crescimento é muito alto para um laboratório de ensino e inclusive para alguns laboratórios comerciais. Uma possibilidade é a adição nos meios de água de coco, porque esta contém reguladores de crescimento análogos à cinetina, que estimulam a divisão celular.

Além da água de coco, outras substâncias de origem vegetal interessantes são a polpa de banana e os sucos de tomate, de laranja, de uva e de abacaxi. Pouco utilizadas na pesquisa científica, estas substâncias alternativas de composição mal definida substituem, no laboratório de ensino, alguns reagentes caros ou de difícil obtenção.

No Brasil, a água de coco é um produto barato e fácil de encontrar, de modo que pode ser incluído habitualmente no meio para estimular o crescimento dos explantes. Para induzir a embriogênese ou a organogênese do explante, substitui-se a água de coco por um volume equivalente de água destilada.

Uma vez dominada a técnica para o estabelecimento de uma cultura asséptica, pode-se comparar o crescimento em meios de diferente composição, utilizando uma adaptação de Piérik que permite obter 27 combinações, das quais será escolhida a que apresentar melhores resultados.

Açúcar (sacarose) 1-2-4%

Sais minerais (M&S ou Taji) 1:4; 1:2; 1:1

Água de coco 25%, 50%, 75%

15. MEIOS DE CULTIVO CLÁSSICOS

Em função de sua complexidade, os meios para o cultivo in vitro de tecidos vegetais podem resultar assustadores para o iniciante. Em relação a fórmulas tradicionais como a de Knop (1865), as principais modificações nas fórmulas modernas, são a introdução de micronutrientes (Hoagland, Murashige&Skoog, White, Gamborg, Nitsch)) e o uso de um agente quelante, geralmente EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), formando com o ferro um complexo estável que não precipita.

A preparação das fórmulas modernas é complexa e só se justifica quando o volume é muito grande. Na maioria dos casos resulta mais conveniente adquirir a mistura em pó do fabricante.

MEIO DE MURASHIGE&SKOOG

De acordo com o fabricante (Sigma), o meio basal de Murashige e Skoog M5524 contém os macro e micronutrientes da fórmula clássica original. Pode ser complementado com vitaminas, sacarose, ágar bacteriológico, auxinas (IAA) e citocininas de modo a gerar um meio completo para o crescimento dos cultivos de tecidos vegetais. A formulação demanda 4,3 g de pó por litro de água destilada, na qual se acrescentam 10-50 g de sacarose e 6-8 g de ágar bacteriológico.

Preparação (100ml)

1. Pesar 0,43 g de meio M&S e dissolver em 90 ml de água destilada

2. Acrescentar 2,5 g de sacarose ou de açúcar cristal.

3. Juntar 0,7 g de ágar bacteriológico e esquentar até que este derreta (*).

4. Avolumar a 100 ml e misturar bem.

5. Dispensar nos frascos uma camada de 2 cm de profundidade.

6. Fechar os frascos e esterilizar na panela de pressão (20 a 25 minutos contados a partir do momento em que a válvula deixa escapar vapor).

(*) O ágar derrete quando temperatura passa de 90 graus Celsius e solidifica quando a temperatura desce de 50 graus Celsius.

VARIAÇÕES DO MEIO DE MURASHIGE&SKOOG

MEIO DE M&S COM A METADE DA CONCENTRAÇÃO

Por ser um meio muito rico em sais, o meio de M&S pode ser utilizado na metade da concentração anterior. Neste caso a formulação demanda 0,27 g de meio M&S em 100 ml de água destilada, mantendo as quantidades de sacarose ou açúcar cristal e ágar.

PREPARAÇÃO DA ÁGUA DE COCO

Extrair, misturar e filtrar a água de 3 cocos verdes. Depois de separada em alíquotas, estas serão guardadas no congelador até o momento de usar.

Além da água de coco, outras substâncias de origem vegetal interessantes são a polpa de banana e os sucos de tomate, de laranja, de uva e de abacaxi.

MEIO DE M&S COMPLEMENTADO COM ÁGUA DE COCO

Substituir a metade da água por água de coco.

16. MEIOS DE CULTIVO ALTERNATIVOS

A necessidade de utilizar meios bem definidos se aplica fundamentalmente à pesquisa científica. Para o horticultor ou para o docente essa necessidade é menor e, em muitos casos, os meios alternativos são suficientes para obter bons resultados. Apesar de utilizar o meio M&S comercial, nossos primeiros trabalhos foram realizados com meios alternativos simples e econômicos, como o meio do Professor Acram Taji (1996), cuja composição deriva do meio de Bridgen (1986). O acréscimo de água de coco nos permitiu substituir, até um certo ponto, os fatores de crescimento.

MEIO DE COCO

Este meio foi o primeiro que utilizamos para cultivar calos de cenoura, com sucesso.

Preparação da água de coco: Extrair, misturar e filtrar a água de 3 cocos verdes. Depois de separada em alíquotas, estas serão guardadas no congelador até o momento de usar.

Composição do meio: 50 ml de água de coco, 50 ml de água destilada, 1 a 5 g de açúcar cristal, 0,7 g de ágar bacteriológico.

Preparação do meio

1. Dissolver o açúcar e o ágar em 50 ml de água destilada.

2. Esquentar o meio até que o ágar derreta (*).

3. Acrescentar 50 ml de água de coco e misturar bem.

4. Dispensar nos frascos uma camada de 1 a 2 cm de profundidade.

5. Fechar os frascos e esterilizar na panela de pressão durante 25 minutos, contados a partir do momento em que a válvula deixa escapar vapor.

(*) O ágar derrete quando temperatura passa de 90 graus Celsius e solidifica quando a temperatura desce de 50 graus Celsius.

MEIO DO PROFESSOR ACRAM TAJI

Este meio, também adotado pelo grupo dos “Home Gardeners”, difere do meio original de Bridgen na concentração de sais, maior no meio Taji. A grande vantagem é que todos os produtos que entram na composição podem ser encontrados em farmácias e lojas de plantas.

MEIO TAJI BÁSICO

Composição: 2 copos de água de chuva (ou água destilada), ¼ de copo de açúcar, 1 copo de uma solução de sais minerais (1/2 colher das de sopa de fertilizante NPK 10:10:10 dissolvido em 1 litro de água), ½ tablete de 500 mg de inositol, ½ tablete multivitamínico com tiamina (ou vitamina B em gotas, 4 colheres das de sopa de flocos de ágar (ou ágar bacteriológico na concentração 0,7 a 0,8%).

Preparação

Misturar os componentes do meio e, antes de acrescentar o ágar, verificar o valor do pH que deve estar entre 5 e 6. Se for necessário, ajustar o pH com ácido cítrico ou com bicarbonato de sódio. Esquentar o meio junto com o ágar até que este derreta (*) e dispensar nos frascos uma camada de 2 cm de profundidade. Fechar os frascos e esterilizar na panela de pressão durante 25 minutos, contados a partir do momento em que a válvula deixa escapar vapor.

(*) O ágar derrete quando temperatura passa de 90 graus Celsius e solidifica quando a temperatura desce de 50 graus Celsius.

MEIO TAJI PARA MULTIPLICAÇÃO

Acrescentar ao meio básico Taji ½ copo de água de coco e ½ colher das de chá de malte. Mediante a substituição do coco por ½ copo de purê de tomate verde ou de suco de laranja recentemente exprimido, serão obtidas respostas diferentes. Preparar os frascos como indicado anteriormente.

BIBLIOGRAFIA

HORTICULTURAL SCIENCE & PLANT BIOTECHNOLOGY GROUP

17. A DESINFECÇÃO DOS INSTRUMENTOS

As técnicas de cultivo de tecidos vegetais consistem na transferência de um explante a um meio de cultura estéril, em condições assépticas. Evitar a contaminação microbiana do meio de cultura é uma das maiores dificuldades técnicas, porque demanda tanto a desinfecção dos explantes como a esterilização dos instrumentos utilizados.

Palitos acondicionados individualmente podem ser adquiridos no comércio a baixo custo. Resultam estéreis e são descartáveis

Facas e pinças embrulhadas em papel alumínio devem ser esterilizadas por calor úmido (autoclave, 25 minutos na panela de pressão), ou por calor seco (no forno, 3 horas a 160 graus Celsius). A escolha de um ou outro método depende da presença de partes de plástico que possam derreter se o calor for excessivo.

Do ponto de vista prático, a utilização de facas e pinças estéreis resulta inviável ao longo de todo o procedimento de transferência dos explantes. Contudo, os instrumentos podem ser reutilizados uma vez desinfetados adequadamente, por imersão em uma solução com hipoclorito de sódio, álcool ou água oxigenada.

As concentrações desses produtos podem variar em função das condições de armazenamento e nem todos são eficientes na eliminação dos esporos bacterianos. Por isso consideramos indispensável testar a desinfeção dos instrumentos antes de começar a trabalhar com cultura de tecidos.

BIBLIOGRAFIA

SMITH R. A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, Virginia. National Association of Biology Teachers, 1997.

OBJETIVO: Verificar e comparar a eficiência dos desinfetantes usuais do laboratório, na limpeza dos instrumentos que serão utilizados nas culturas de tecidos vegetais.

MATERIAIS

Duas placas de Petri com ágar nutriente estéril, 1 tubo com caldo nutriente inoculado com Bacillus subtilis, 1 tubo com caldo nutriente inoculado com Escherichia coli, 2 pinças esterilizadas previamente por calor úmido ou seco, dois béqueres com o desinfetante a avaliar (um para B. subtilis, outro para E.coli).

PROCEDIMENTO

Seguir as normas de trabalho standard .

1. Dividir a placa de Petri em 3 setores, como indicado no esquema ao lado (Controle, 1 e 2).

2. Com a pinça estéril, fazer um traço no setor C.

3. Molhar a ponta da pinça no cultivo de Escherichia coli e fazer um traço no setor 1.

4. Deixar a pinça em um dos béqueres com desinfetante, durante 15 minutos.

5. Retirar a pinça, deixando escorrer o excesso de líquido, e fazer um traço no setor 2

6. Repetir o procedimento anterior na segunda placa, com outra pinça estéril, o outro béquer com desinfetante e o cultivo de Bacillus subtilis.

7. Incubar ambas as placas a temperatura ambiente, até que o crescimento bacteriano no setor 1 seja evidente.

8 Analisar os resultados.

NOSSO COMENTÁRIO

Em função da limitação de material e do alto número de contaminações ocorridas no laboratório de ensino, procedemos a testar a eficiência de vários desinfetantes com Escherichia coli e com Bacillus subtilis, uma bactéria que esporula.

Os desinfetantes escolhidos foram os de uso habitual: água sanitária (marca Globo), água oxigenada 30%, etanol 92,80, etanol 700 e CLOR-in 10 (Dicloro-S-Triazinetione de Sódio). Adaptou-se o procedimento detalhado anteriormente a cada desinfetante, como a seguir:

1. Água sanitária

Imersão da pinça contaminada em uma solução de água sanitária 50% (v/v) durante 20 minutos e posterior enxague em uma solução de água sanitária 5 % (v/v).

A concentração pode parecer muito alta, especialmente em relação a aquelas recomendadas nos protocolos de autores ingleses e norte-americanos. Em seus países, a concentração normal de hipoclorito de sódio na água sanitária comercial é de 5%. No Brasil, essa concentração é de 2 a 2,5 %, de modo que adaptamos as recomendações desses autores a nossas condições.

2. Água oxigenada

Imersão da pinça contaminada em uma solução de água oxigenada 3% (v/v) durante 20 minutos.

3. Etanol (92%, 80% e 70%)

Imersão da pinça contaminada em etanol 92,8% ou em etanol 70%, durante 20 minutos.

4. Clor-in 10

Imersão da pinça contaminada em uma solução de Clor-in 10 (1 tablete/500 ml) durante 20 minutos.

Paralelamente, realizou-se um controle com água destilada estéril (tempo de imersão, 20 minutos).

Os resultados esperados eram os seguintes:

Setor C: sem crescimento microbiano ao longo do traço feito com a pinça (Controle do teste de esterilidade),

Setor 1: crescimento da bactéria inoculada (Escherichia coli ou Bacillus subtilis)

Setor 2: o crescimento bacteriano indicaria a ineficiência do desinfetante utilizado; a ausência de crescimento mostraria sua eficiência.

Os resultados encontrados estão na Figura 2 e na Tabela 1. Os melhores desinfetantes foram a água sanitária, a água oxigenada e o Clor-in 10. Nenhuma das duas concentrações de etanol se mostrou eficiente em relação a Bacillus subtilis.

Tabela 1: Eficiência de vários produtos na desinfeção das pinças.

(+: tratamento eficiente; -: tratamento ineficiente)

18. A DESINFECÇÃO DOS EXPLANTES

Um dos passos mais críticos nas técnicas de cultivo in vitro é a desinfecção dos explantes, que começa com um bom lavado em água e sabão ou detergente. Uma vez o explante bem limpo procede-se à desinfecção com agentes químicos. Os mais econômicos e simples de usar são o álcool 70% e o hipoclorito de sódio, vendido comercialmente como água sanitária no Brasil, lavandina na Argentina e água Jano no Chile e outros países latino-americanos.

Uma imersão de 1 a 2 minutos em álcool 70% permite eliminar bolhas de ar e dissolver a camada epicuticular dos explantes, mas não garante a esterilização do explante. Essa é a função da água sanitária.

Em muitos países a concentração de matéria ativa (NaClO) da água sanitária é de 5%, e os protocolos correspondentes recomendam utilizar diluições de 10 a 20% (v/v). No Brasil, onde a legislação determina que o teor de matéria ativa (NaClO) da água sanitária seja de 1,5 a 2%, a diluição equivalente para a desinfecção do explante está entre 25 e 50%

Nós preferimos fixar em 50% a concentração da solução desinfetante de água sanitária e modificar o tempo de imersão em função do tipo de explante. Como medida adicional a solução desinfetante é preparada em um frasco estéril. Vale a pena destacar que uma desinfecção externa bem-sucedida não elimina as contaminações internas, que podem aparecer dias mais tarde de semeado o explante.

Uma vez desinfetado o explante, retira-se o hipoclorito em três lavados sucessivos com água destilada estéril. A duração dos lavados é de 1, 3 e 5 minutos, sendo que no último lavado o explante pode permanecer mais tempo.

Para o lavado existem duas técnicas, sendo que a escolha depende do tamanho e do número de explantes a esterilizar. A primeira é retirar o material e transferi-lo aos recipientes com água destilada estéril, um procedimento prático se o número de explantes for pequeno).

A segunda é abrir ligeiramente o frasco para descartar o líquido, derramando o conteúdo na pia ou em um balde de descarte (Figura 2). Antes e depois deste procedimento recomenda-se limpar cuidadosamente a tampa e o exterior do frasco com álcool. Esta última é nossa preferida.

Se for necessário cortar o material ou eliminar as partes queimadas pelo hipoclorito de sódio, prever a esterilização dos instrumentos e de uma caixa de Petri contendo uma folha de papel toalha, onde será realizada dissecção.

TÉCNICA PARA DESINFECTAR OS EXPLANTES

NOSSO COMENTÁRIO

A preparação de numerosos frascos de água destilada estéril consome muito tempo, de modo que tentamos substitui-la nos lavados por uma solução de Clor-in 10 (Dicloro-S-Triazinetione de Sódio ou NaDCC), um produto vendido no comercio local para desinfetar utensílios e legumes, na concentração e o tempo indicados pelo fabricante.

O Clor-in pode ser preparado na hora e não precisa de enxague. O maior inconveniente é que o material fica um pouco grudento, e isso pode dificultar a transferência dos explantes com a pinça aos tubos de ensaio.

Em função de nossa experiência, vale a pena ressaltar que os testes de desinfecção dos explantes só com Clor-in 10, sem utilizar água sanitária, só dão resultados aceitáveis quando o meio de cultivo não contém sacarose.